5-基因工程与基因重组教程解析.ppt

IMAU, Huo XW 第五讲 基因重组与基因工程 Recombinant DNA Technique and Genetic Engineering DNA片段的连接 重组DNA分子构建的最后一步是连接，通过连接酶完成。相对而言，钝端的连接效率较低，因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会。而粘性末端的连接效率较高，因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对。这种暂时的、碱基配对结构可以提高连接的效率。在分子克隆的连接方式主要有以下几种： 一、连接方式（一）相同粘性末端的连接　　来源:　　　相同的酶　　　同尾酶　　问题:　　　极性有两种可能 　同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。 （二）平头末端的连接　　粘性末端--分子内部连接，平头末端--分子间的连接。　　提高连接效率的方法： 　　加大酶用量（10倍） 　　加大平头末端底物的浓度　　加入10%PEG（8000），促进分子间的有效作用 　　加入单价阳离子， 150-200mM NaCl　　提高反应温度　　平头连接同样存在两种极性 （三）不同粘性末端的连接　　突出5末端　　Klenow补平，或S1核酸酶切平，然后平头连接　　突出3末端　　T4-DNApol切平，然后平头连接　　突出末端不同 　　Klenow补平，或S1核酸酶切平 　　连接后，可能恢复限制性位点