一株土壤分离的青霉降解纤维素活性的研究.docVIP

一株稻田土壤分离青霉降解纤维素活性的研究 生物科学专业 学生:彭娅萍 指导教师:李玉中摘 要:本文以衡阳市稻田土壤分离筛选到的一株青霉(编号:1-4)为对象,进行了鉴定和纤维素降解活性的研究(CYA)上进行形态鉴定,然后对该菌进行液体发酵,取发酵液的离心滤液作为粗酶液,采用滤纸酶活法测定其降解纤维素的能力(Penicillium donkii)?酶活测定结果表明该菌在第8天酶活力达到最大,为16.69U/mL,为其开发利用的进一步研究提供了理论依据关键词:冬克青霉;鉴定;纤维素降解酶;酶活力测定农业稻草秸杆是一种非常丰富的多糖资源,但目前利用率非常低,生物降解方法相对化学,此法具有降解率高,安全环保,成本低等优点[1-6]?其中,纤维素酶的研究是纤维素降解的关键,筛选高活力的酶是该领域研究的一大重点,由国际理论和应用化学联合会(IUPAC)创立和推广的以Whatman No.1号滤纸(日本用东洋1号)作为底物的滤纸酶活测定法是测定纤维素酶组分总活力最普遍的方法[7,8],国内许多人对纤维素酶的测定方法及影响因素做了深入研究[9-13],并有文章报道该酶可广泛用于食品 [14]?由此看来,纤维素酶的研究具有重要的应用价值本文目的在于对从衡阳市农村稻田土壤中分离筛选出来的一株编号1-4的青霉进行鉴定并测定其酶活力,为该菌可否作为高效纤维素降解菌提供理论依据1 材料和方法1.1 实验材料1.1.1 样品来源菌株是从衡阳市祁东县水稻田土壤中分离筛选出的一株青霉编号为1-4,现保存于衡阳师范学院生命科学系生物基础实验室1.1.2 主要试剂及培养基配方DNS试剂配制参考林金秀的方法[13] 柠檬酸缓冲液(0.05mol/L,pH=5.0):取柠檬酸5.2535g,定容到250mL,为A液;柠檬酸三钠7.3525g,定容到250mL,为B液;取51.25mL A液和73.75mL B液混合后,定容到250mL PDA培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂粉20g,水1000mL,自然pH 种子培养基:CMC-Na10.0g,蛋白胨10.0g,酵母膏10.0g,KH2PO4 2.0g,(NH4)2SO4 1.5g,蒸馏水1000mL 液体发酵培养基:CMC-Na 5g,蛋白胨3g,牛肉膏1g,蒸馏水1000mL,自然pH值,121℃下高压灭菌20min 鉴定培养基(CYA)配制参考孔华忠的方法[15] 1.2 试验方法1.2.1 实验菌种的纯化从前期试验的初筛培养基上挑取目的菌用无菌水稀释,涂布到新倒好的3个PDA平板上,用保鲜膜封好,置于28℃的恒温培养箱中培养4d,每天注意观察其生长情况,再次从涂布接种的平板上挑取长成散状小点的目的菌划线接种到新的平板上1.2.2 菌株鉴定利用三点接种法将菌株接种到鉴定培养基(CYA)上,平板置于30℃恒温箱中培养一周,根据得到的单个菌落的颜色做出初步判断用接种环挑取菌种孢子,在新的平板培养基的一侧进行划线接种,然后在接种处斜插入无菌盖玻片,培养5-7d,用镊子小心取出盖玻片,将其背面附着的菌丝体擦净洁净的载玻片上,在显微镜下观察菌丝,参阅《中国真菌志》第三十五卷[15]对青霉1-4进行鉴定1.2.3 制作标准曲线取50mg葡萄糖,加蒸馏水溶解,定容至50mL,为1mg/mL葡萄糖标准液5支试管,按表1往试管加入葡萄糖标准液和蒸馏水,再加入1.5mLDNS试剂,沸水浴5min,自来水立即冷却,蒸馏水定容到10mL,540nm比色表1 3,5-二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线的制作 试管编号0 1 2 3 4 葡萄糖标准液(mL) 00.2 0.4 0.6 0.8 蒸馏水(mL) 2.01.8 1.6 1.4 1.2 1.2.4 FPAase测定粗酶液制备:将纯化到的菌株接种到种子培养基中,28℃,180 r/min培养2~3d制成种子液6个250mL的锥形瓶,每个锥形瓶里装入100mL的发酵液2mL种子液,于28℃,180 r/min的摇床中培养,4d后每天测定其FPAase8mL于10mL离心管,平衡后于4000r/min下离心10min,上清液即为粗酶液滤纸处理:使用前将其用1%的醋酸溶液浸泡一昼夜以除去淀粉,用碘液检验,再用2%的NaHCO3溶液洗至中性,晒干酶活测定:采用3,5-二硝基水杨酸(DNS法)测定总纤维素酶活力一滤纸酶活(FPAase):在4支试管中分别加入50mg经去淀粉处理后的定性滤纸,加1mL柠檬酸-柠檬酸钠液冲液(pH值5),置于50°C水浴中预热5min,再加入1mL粗酶液,其中一支不加酶液做为空白管,轻轻摇匀,使滤纸完全浸泡在液体中50℃水浴反应60min,立即向各管加入1.5mL的DNS试剂,再于空白管中加入粗酶液1mL,摇匀,将4支试管同时煮沸