微量凯氏定氮法测定蛋白质含量摘要.docVIP

前言 蛋白质是生物体中含量最高,功能最重要的生物大分子,与生命的起源和进化都密切相关,因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究,一直是化学家及生物学家极为关注的问题,其含量的测定在生化分析和临床分析中具有重要意义,研究和开发新的、高灵敏度的蛋白质测定方法是生物化学研究的一个活跃领域。 近年来蛋白质测定的方法的研究进展,包括分光光度法、双缩脲法、凯氏定氮法、电泳分析法、质谱分析法。总结各种方法的特点及适用条件。质谱分析是测定结果最准确的测定方法;凯氏定氮法适用范围最广泛,分光光度法是最为简便快速的测定方法。 蛋白质在生物体内占有特殊的地位,它和核酸是构成原生质的主要成分,是生命现象的物质基础。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源。具有糖类和脂肪不可替代的作用。作为生命的物质基础之一,蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用。蛋白质的分离与定性、定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床检验、疾病诊断、生物药物分离提纯和质量检验中最重要的工作。 Johan Kjeldahl 1849-1900 ,在嘉士伯实验室发明了测定凯氏定氮法,这种方法到目前仍然是我们测定谷物类物质蛋白质含量的主要方法 的主要方法 凯氏定氮法 将蛋白质样品在硫酸铜的催化下,用氧化性试剂消化分解转化为铵离子,然后将含有铵试液置于蒸馏瓶中,加高浓度碱使铵离子转化为氨,再加热蒸馏,用过量的标准硼酸溶液吸收氨气,再用盐酸标准溶液滴定H2BO3,以甲基红作为指示剂。通过计算铵离子的量计算蛋白质含量。 凯氏定氮法测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大; 李宁认为凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法,适用样品广泛,测试结果准确。 王雅认为凯氏定氮法样品的最佳消化条件为 GuSO4?5H2O2.50g,K2S O40.10g,浓H2SO44.00ml;GuSO4?5H2O的用量为影响消化时间的主要因素,K2SO4和浓 H2SO4用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件作试 验,消化时间仅为12min;与其他GuSO4?5H2O、K2SO4、浓 H2SO4用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用 量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。 邓小超等认为:对凯氏定氮装置进行了改进,用高压锅做水蒸气发生器,串连几套定氮仪,可同时测定几份样品。节省时间,提高了工作效率。改进后的方法适用于批量食品蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 [1]李宁.几种蛋白质测定方法的比较.山西农业大学学报.2006;26 2 ;132-134 [2]王雅.蛋白质测定实验的研究.实验室研究与探索.2005;24 4 58-59 [3]邓小超、吕爱娜、潘永丽.食品中蛋白质测定方法的 改进.职业与健康.2005;21 6 833 实验目的 1、学习微量凯氏定氮法的原理 2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等） 二、实验原理 1、凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。 2、当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称为“消化”。 3、此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 4、消化过程 含氮有机物 + H2SO4 → CO2 + SO2 + H2O + NH3 2NH3 + H2SO4 → NH4 2SO4 5、蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： NH4 2SO4 + 2NaOH → Na2so4 + 2NH4OH NH4OH → H2O + NH3 6、吸收与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（即滴定至蓝紫色 ，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。 NH3 + H3BO3 → NH4H2BO3 NH4H2BO3 + HCL → NH4CL + H3BO3 三、实验材料与试剂 实验材料： 食用面粉 实验试剂： 浓硫酸 30%氢氧化钠溶液 克氏催化剂 2%硼酸 指示剂 0.01M HCL 实验器材： 凯氏烧瓶 电炉 凯氏定氮蒸馏装置 锥形瓶 100ml容量瓶 酸式滴定管 操作步骤 1、消化： （1）准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上。向另一烧瓶加入1ml水作