实验二(研究生分生).ppt

实验二和实验三是以获取纯化的表达蛋白质为目的，从RNA提取开始，经过RT-PCR获取特定基因的cDNA片断，再进行重组、筛选获取克隆，最后进行基因编码蛋白质的表达、纯化、和检测。 第一天 1.小鼠脑总RNA的提取； 2. RNA含量测定； 3. RT-PCR 4.载体酶切 第二天 1.琼脂糖凝胶电泳检测检查RNA及PCR产物； 2. RT-PCR产物的纯化； 3. PCR产物的快速酶切； 4.载体及PCR酶切产物的乙醇沉淀纯化； 5.琼脂糖凝胶电泳检测检查载体及PCR酶切状况，DNA浓度的微量测定； 6.连接反应 第三天 1.感受态细菌的制备； 2.细菌转化 从组织中一步法分离总RNATotal RNA isolation from tissues by One-Step RNA Purification Method 1、取小鼠，断颈处死，用剪刀沿小鼠枕骨断开小鼠颈椎，露出枕骨大孔，然后从枕骨大孔分别向两侧剪开小鼠颅骨，用镊子小心向上掰开顶骨，取出暴露的大脑。 （取出肝脏-20 ℃冻存） 2、玻璃匀浆器中加入4ml的RNAiso试剂置冰上待用。 3、立即取出脑组织，移入玻璃匀浆器中，立即在冰浴中上下研磨十次左右进行匀浆。 4、然后将匀浆液平均转移入4只2ml离心管中，室温静置5分钟。 5、加入0.4ml氯仿，盖紧管口，用力颠倒离心管3-5次进行混合，室温再静置5min后。 6、12000rpm 4℃离心10min；用移液器将上层水相分别转移入1.5ml离心管，每只600μL。 7、加入600μL异丙醇，颠倒混匀后室温静置5-10min，15000rpm 离心5min。 8.用移液器将上清去净后，加入1mL DEPC处理过的75%乙醇，振荡片刻，再于15000rpm离心5min；再次去净上清，敞口室温静置5-15min，待RNA沉淀略干。 9.每管中加入DEPC处理过的蒸馏水100μL溶解RNA， 4℃保存备用。 RNA含量的紫外分光光度计测定Determination of RNA contents by UV-Spectrometer 操作：取两只比色杯，一只加入1470μL DEPC处理过的蒸馏水，再加入30μL RNA液；一只加入1.5mL DEPC处理过的蒸馏水 混匀后置紫外分光光度计中，分别测定其在260nm和280nm的光吸收值，计算出二者的比值与RNA溶液浓度。 一步法RT-PCR制备cDNAcDNA Preparation by One-Step RT-PCR RT-PCR采用一步RT-PCR试剂盒（TransGen Biotech) 每组取一薄壁反应管（200 uL） 反应条件 45 ℃ 30min 水浴箱 PCR仪 94 ℃ 2min 94 ℃ 30sec 55 ℃ 30sec 进行30次循环 72 ℃ 180sec 72 ℃ 5min 载体DNA的酶切 取1.5ml离心管，按下列表中所列加入组分： 1 载体DNA DNA溶液（μl ） 20 10 X 缓冲液 5 dH2O 23 混匀后分别加入相应的酶 Bam HI (GGATCC) 1 CIAP 1 混匀，37℃温浴 过夜 琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis 1、琼脂糖胶模的准备： 2、样品准备：向每一只样品管中加入9 uL样品、1 uL 10 X 上样液，混匀备用。 PCR产物（DNA）的纯化Purific