凝胶过滤和亲和层析资料讲解.ppt

2）、有实际应用价值的基质 (1)纤维素 (2)交联葡聚糖 (3)琼脂糖 (4)交联琼脂糖 2、间隔臂 配位体直接和基质骨架偶联，它与互补蛋白质的相互作用将受到空间阻碍的影响。配位体必须远离网络骨架。一般是将配位体与基质骨架间加入一段长链，称为间隔臂。 1）、间隔臂的长度 一般认为，为了互补大分子获得最佳相互作用，配位体与骨架间必须插入至少4到6个亚甲基的臂。然而，当互补大分子的分子量低或与配位体亲和性高，则间隔臂长度不像大蛋白质分子或低亲和系统中那样严格。 目前还有采用长链间隔分子的,如聚赖氨酰丙氨酸，分子量约260,000，纯化作用较短链强。 2）、间隔臂的性质 惰性间隔分子：原认为脂肪族碳氢化合物是惰性的，但是实验证明存在空间干扰和非特异吸附。 亲水性间隔分子：在长轴方向引入极性基团，如二级胺、羟基、肽能极大降低非特异性吸附作用，但亲和层析结果不好。 疏水性间隔分子： 甘氨酸倍半肽（亲水）对肝葡糖激酶吸附差 6-氨基乙酸（疏水）对肝葡糖激酶吸附好 3、配位体 配位体对欲纯化的溶质有特异的亲和性. 1）、大分子与配位体的亲和力 配位体与互补大分子间的亲和力是选择高效固定配位体要考虑的一个重要因素。解离常数应在10-4—10-8，当10-4时，亲和力太低，不易成功分离，10-8时，亲和力太高，不易保持活性洗脱。 式中，E为酶浓度，L为配位体浓度， EL为酶-配位体复合物， KL为解离常数 KL= = E0, L0为起始浓度，大多数情况下L0E0, L0EL, KL= ) L0, = 2）、配位体和基质的连接方式 不溶性底物必须具有功能基，经化学修饰可与基质连接，并且不损害或破坏与互补酶的相互作用。这使配位体选择和连接方式带来难度。 e表示位点不与互补酶作用，其它任何位点（a-d）连接生成的吸附剂不是部分有效就是无效。 腺嘌呤核苷-5’-单磷酸与基质连接有几种方式，其中乳酸脱氢酶与（a）结合最强，（c）次之，（b）再次，（d）无亲和性。 3）、配位体的浓度 [EL]= / ( ) 式中表明以单位体积凝胶所含克分子数表示的结合酶[EL]浓度受到固定配位体浓度的限制。 但实际上凝胶中配位体表观或有效浓度约为化学测定值的1%或更低。一般采用最大配位体浓度。 对于亲和力强不易洗脱的情况，减少配位体浓度即可将蛋白质在较温和地条件下洗脱下来。 如果配位体具有电荷，浓度过高能引起色谱畸变。一般认为配位体浓度在10-3M,对酶的纯化效果最好。因为10-3M, 配位体彼此相距较远，足以防止非特异性蛋白质同时与一个以上带电配位体发生相互作用。 （1）溴化氰活化的琼脂糖4B： （2）AH-琼脂糖4B：具6碳臂， （3）CH-琼脂糖4B：具6碳臂， （4）活化的CH-琼脂糖4B：具6碳 臂和活性脂， （5）环氧活化的琼脂糖6B：具亲 水臂， （6）活化的含硫琼脂糖4B：具谷 胱甘肽臂， （7）含硫丙基琼脂糖6B： 具亲水 性臂， 结合含伯氨基配体 结合羧基配体 结合氨基配体 结合含胺基 配体 结合含羧基、胺基、巯基 结合巯基配体 结合巯基、重金属、卤化脂、肪烃及、可与含C=O、C=C、N=N者加成. 二、偶合胶 在凝胶基质上连接某种功能基团，可以快速、容易、安全地固定配体，这种凝胶称偶合胶。 1、常用的偶合胶 2、配体与溴化氰活化的琼脂糖4B的偶合方法： (1)膨化和洗涤胶 a.1mM HCl将冷冻干燥的粉末膨胀15分钟 b.垂熔漏斗过滤下，用盐酸洗涤 (2)偶合配体 a、配体溶液的配置，用偶合溶液(0.1M NaHCO3, pH8.3, 含0.5M NaCl)溶解配体蛋白质(5-10mg/ml胶) b.用偶合溶液洗涤胶数次 c.立即将配体溶液倒入胶内并搅拌(不能用电磁搅拌)。这个步骤要迅速，因为在这个pH下胶的活性基团易破坏。室温2小时，4℃过夜。 (3)阻断过剩的活性基团.偶合之后,一些活性基团仍保留在胶上,应采取 a、温和的碱溶液过夜或Tris-HCl缓冲液2小时 b、加过量的小的伯胺(1M乙醇胺或0.2M甘氨酸等) (4)洗涤产物 为了去掉偶合后游离的配体，偶合缓冲液，乙酸缓冲液洗涤产物，以保证没有游离配体以离子形式与固定配位体结合，同时洗掉阻断剂。 (5)储存