实时荧光定量PCR技术重点.ppt

实时荧光定量PCR技术 主要内容 实时荧光定量PCR的基本原理 Chromo4介绍 实时荧光定量PCR实验程序的建立 实时荧光定量PCR的应用 主要内容 实时荧光定量PCR的基本原理 Chromo4介绍 实时荧光定量PCR实验程序的建立 实时荧光定量PCR的应用 内标基因的选择 原则：内标基因在不同组织或者处理前后表达量不变 内标基因的选择 一般选取GAPDH、 β-actin等看家基因 (GAPDH:Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 3－磷酸甘油醛脱氢酶) 不同读板温度对实验结果的影响：80℃ 不同读板温度对实验结果的影响：86℃ Taqman探针反应体系的设计 引物、探针设计原则： 优先选择探针的序列； Tm值应比引物的Tm值高8－10度（68－70）； GC含量：30－80％； 长度不应超过30碱基，18-30bp, optimal 20 ； 5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素。 Taqman探针反应体系的设计 选择合适的模板链，使探针的CsGs； 扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp。避免相同碱基连续出现，特别是四个或四个以上Gs连续出现； 引物应尽量靠近探针； 引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基； 避免引物、探针之间的二级结构。 Taqman探针反应体系的设计 引物、探针浓度的优化 目标：最高的信号/背景比，最小的Ct值 引物浓度：50nM－900nM 探针浓度：50nM－250nM 通过多次实验确定各自的浓度和比例 Taqman探针的不足 采用荧光淬灭及双末端标记，淬灭难以彻底，本底较高； 采用酶外切活性，受酶性能影响； 探针标记成本较高。 改进：用不发光的淬灭荧光分子取代TAMRA 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR的应用 Chromo 4介绍 实时荧光定量PCR技术的应用 病原体检测； 肿瘤研究； 基因表达研究； 免疫组份分析； 基因突变及多态性的研究 实时荧光定量PCR技术的应用 病原体检测： 检测患者血清中肝炎病毒浓度为临床药物治疗和疗效观察提供依据； 检测HIV的量预测发病时间； 选择治疗药物：干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。 实时荧光定量PCR技术的应用 肿瘤研究： 癌基因及其相关基因的定量检测可进行肿瘤的早期诊断、分型、分期和预后判断； 检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，作为治疗效果和估计复发危险性的依据。 基因差异表达研究 标准曲线法 使用标准曲线来确定基因表达上的差异 相对定量法(2－△△Ct法) 不使用标准曲线，直接分析得到基因差异表达的倍数关系 标准曲线法 步骤： 1.通过标准曲线分别测出目标基因和内标基因的量 2.均一化校正（Normalization) 3.比较不同样品间目标基因表达差异 相对定量法 前提 目标基因和看家基因的扩增效率一致，且接近100％。 步骤 通过实时荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值 均一化校准 △Ct=Ct目标基因－Ct看家基因 △△Ctn= △Ctn－ △ Ct0（不同时间、不同组织) 基因差异表达的倍数＝2－△△Ct 基因突变及多态性-SNP检测 TaqMan? MicroRNA 分析方法加长靶基因的反转录荧光定量PCR miRNAs的研究 MicroRNAs 是一种内源性长度在２２个碱基左右的RNA分子，它在动植物中具有重要的基因调控作用，它们通过与 mRNAs结合抑制翻译或造成 mRNAs 被酶解切割而起作用　 目前在各种生命体中发现的miRNAs类型共有约 700种以上,通过实验验证或经数据库和软件推测 其中人源的约有２００种　 高丰度存在：平均每个细胞中约有50,000个拷贝 为什么miRNAs非常重要 ? MicroRNAs 是一类新的基因调控因子　 某些miRNAs控制了动植物的发育 　 理解miRNA 的功能将帮助现在流行的siRNA 实验结果：RNA干扰／基因沉默 MicroRNAs 有可能成为新型的疾病标志物 MicroRNAs 可能具有重要临床应用价值 现有的miRNA检测方法 克隆法Cloning 杂交法Northern Blot Ribonuclease Protection-based PAGE电泳法 基因芯片法Microarray-based miRNA profiling 上列各种方法均未被证实是有效，准确并且是高度重现的：不少小RNA间只有一个碱基的不同 MicroRNA 定量方法 Estimated synthetic miRNA input (lin-4) in RT bas