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免疫学实验讲义 丁建英 （供10食品质量与安全专业用） 常熟理工学院 生物与食品工程学院 2012．11 实验一 免疫细胞和免疫器官结构观察 一、目的要求 掌握中枢淋巴组织与周围淋巴组织的结构。 掌握胸腺、淋巴结和脾的结构。 了解T、B淋巴细胞在淋巴结和脾内的分布。 二、实验内容 (一)胸腺 肉眼观察：本片取自动物胸腺。标本呈椭圆形，表面为染成红色的结缔组织被膜，可见不完全分隔的小叶，周围染成深蓝色者为皮质，中央色浅者为髓质。 低倍镜:表面有薄层结缔组织构成的被膜，被膜伸入实质形成小叶间隔，将胸腺分成许多不完整的小叶。每个小叶分为皮质和髓质两部分，周围为皮质，胸腺上皮细胞较少，胸腺细胞密集，故着色较深；小叶中央为髓质，相邻小叶的髓质相互连接，胸腺细胞较少，胸腺上皮细胞较多，染色浅；髓质中可见染成红色的胸腺小体(thymic corpuscle)。 高倍镜:胸腺小体是胸腺的特征性结构，散在分布于髓质，大小不等，有数层及十几层扁平的上皮性网状细胞呈同心圆排列而成，外周的上皮细胞较幼稚，呈新月形，细胞核明显；近小体中心的上皮细胞较成熟，核渐退化；小体中心的上皮细胞已完全角质化，细胞呈均质嗜酸性染色，中心还常见巨噬细胞或嗜酸性粒细胞。 （二）淋巴结（lymph node ） 血 型 红细胞内所含凝集原 血清中所含凝集素 O - α+β A A β B B α AB A+B - 玻片法： （一）实验器材 1、抗A血清（标记红色）和抗B（标记绿色）标准血清; 2、采血针、双凹玻片、碘酒、酒精、棉球（棉签）。 （二）实验方法 1、取清洁双凹玻片，用记号笔在左角上注抗A字，右角上注看B字； 2、以碘酒、酒精棉球消毒指端皮肤，针刺受检者指端； 3、在双凹玻片内各加血1滴后，在抗A字端加抗A标准血清1滴，在抗B字端加抗B标准血清1滴； 4、晃动玻片混匀，待3~5分钟后（中间倾斜玻片数次观察结果或用低倍镜观察），观察凝集现象，按下表报告血型结果。 （三）结果判断 表2 血型结果判断 血 型 凝 集 现 象 抗B标准血清 （含β凝集素） 抗A标准血清 （含α凝集素） O - - A - + B + - AB + + [注意事项] 1、用碘酒与酒精认真消毒采血部位； 2、勿用力挤压采血部位防止红细胞溶解，防止血液凝固； 3、应在1~3min内观察结果。 试管法： （一）实验器材 1、抗A血清（标记红色）和抗B（标记绿色）标准血清; 2、采血针、碘酒、酒精、棉球（棉签）、洁净小试管、毛细吸管、水浴箱 （二）实验步骤 1、取洁净小试管两支，分别注明“A”、“B”字样，用毛细吸管滴加抗A血清2滴于A管中，抗B血清滴于B管中。 2、两管中各加待测红细胞悬液2滴，充分摇均，置于室温或水浴箱30分钟后，观察结果，或放置离心机中，1000rpm低速离心1分钟，然后观察结果。 （三）实验结果判断 观察结果时，可将试管斜持，轻摇沉淀血块观察有无凝集块，若不清可在低倍镜下观察。 实验三、双向琼脂扩散实验 、原理双向琼脂扩散实验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散,当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时,就会形成抗原抗体复合物的沉淀。乙醇四、步骤1.取一块干净的玻璃板，用少量75%乙醇冲洗，晾干后置于水平台，将1%琼脂糖融化，56水浴中保温。2.将琼脂糖铺于玻璃板上，厚度约为1㎜。3.打孔，孔距为4㎜4.将抗血清按二倍稀释法稀释成1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32的不同浓度。在周围孔中加入不同浓度的抗体，中心孔加抗原。将凝胶板置于湿盒内，室温过夜，观察结果五、实验结果 浓度不同，形成不同的沉淀的线。　沉淀试验将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法。（1）免疫血清：免疫兔抗人血清； （2）抗原：人血清； （3）小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。 （1）取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入第一管，加时注意不能有气泡； （2）以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管； （3）用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混； （4）置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。 酶联免疫吸附试验（ELISA）：最低检出限不大于0.02μg/kg。 微孔板。 黄曲霉毒素M1标准溶液：浓度范围0～0.10μg/kg。 酶标记物浓缩液。 酶标记物稀释用缓冲液。 显色剂。 柠檬酸缓冲液。