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第四章 植物组织培养的基本方法 外植体的选择 外植体灭菌方法 外植体接种，培养 培养物污染原因和预防措施 外植体褐变及其防止 玻璃化现象及其预防 第一节 外植体选择 1、外植体部位 不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应不一致 2、取材季节 大多数植物，应在生长开始的季节采样 3、器官或组织的生理状态，发育年龄 幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力 4、材料大小 茎尖培养中，外植体越小成活率越高 外植体的两种类型： A.带芽的外植体如茎尖和侧芽 B.分化的组织：茎段，叶，根，花瓣等 第二节 外植体灭菌方法 要去除材料上的微生物，又不能伤及材料。 1、 常用灭菌剂： 既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解。 应当正确选择消毒剂的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡。 一些表面消毒剂的消毒效果。 乙醇（70%—75%）、次氯酸钠溶液（0.5%—10%）、升汞（0.1%—1%）、抗生素类杀菌剂等。 外植体消毒步骤如下： 取外植体 自来水冲洗 70%酒精表面消毒30s后无菌水冲洗 消毒剂处理（在消毒液中加入几滴表面活性剂） 无菌水冲洗干净 备用 一般可将材料冲洗干净后，放入70%酒精中数秒，用无菌水冲洗后再放入升汞（1—10min）或次氯酸钠中（5—30min）消毒。再用无菌水反复冲洗四、五遍，可达到灭菌目的。 不同植物不同部位都有各自的特点，即使同样的植物组织，由于栽培条件或季节不同，污染情况也不同。灭菌方式也有所差异。可参照相似植物的灭菌或是通过实验得到最适灭菌方式。 1.????? 外植体表面灭菌 从室外带回来的材料．除去一些不必要的部分．洗去泥土．然后用皂液或洗衣粉及消洗灵浸泡，冲洗，必要时可用软刷刷洗材料，然后剪成适宜的大小，再行深灭菌。通过表面灭菌可清除许多杂菌，如在马蹄莲根茎的离体培养中，通过清洗根茎外植体的泥土，剥去外面几层包庇物，流水冲洗1小时，可把杂菌清洗掉60％左右（Merel LG, 1998）。 外植体的深灭菌 通过外植体表面灭菌后，仍有一部分杂菌存在于材料表面或内部，必须经过更深层次的的灭菌处理如加消毒药剂、抗生素、水浴、灼烧等措施才能获得不带菌的外植体。下面是几种典型外植体的深灭菌处理程序。 茎段、腋芽、叶等的深灭菌 经表面灭菌后．依材料的不同用70％乙醇浸泡几秒一几十秒．无菌水冲洗1次一2次．再用0．1％HgCl2灭菌3分钟一15分钟，最后用无菌水冲洗3次一6次。必要时，还要进行二次灭菌或多次灭菌。已经证明，二次灭菌或多次灭菌对某些种类的外值体很有效。另外．不同消毒药剂使用浓度和消毒时间各异，效果也可能不同。如用NaClO和Ca(ClO)2的浓度大多是1％一2％和8％一10％，时间是5分钟—30分钟不等。在这些过程中，有时还加一些表面活化剂吐温20或吐温80。通过这些步骤，基本上能把这类外植体的污染率降低到可接受的范围。 球茎、块茎、种子等材料的深灭菌 这些材料的灭菌可先通过水浴处理，然后再用NaClO或HgCl2等杀菌剂灭菌。当然，并不是所有的外植体都能用水浴来进行灭菌，能水浴的外植体与很多因素有关，如材料的大小、湿度、材料的生理状态、包裹物的厚度、生长期的温度条件、材料上的潜伏水平、年龄等，同时，不同的材料要求的水浴温度和水浴时间的长短极不一致。药百合在水温42℃下水浴1小时．污染可由40％一60％降到5％（谭文澄等，1991）。而种子，情况极不一致：小麦种子可在55℃热水中保温3分钟一5分钟，而马占相思的种子则可在100℃下保持1分钟（朱广廉，1996）。经过水浴灭菌处理，可杀死一部分微生物，再经过化学杀菌处理即可达到灭菌的目的。 荚果的深灭菌 将清洗后的荚果转入95％乙醇中，然后取出荚果放入灭菌的培养皿中，点燃灼烧，并不断翻转荚果，待表面燃尽即可获得无菌荚果，再在无菌条件下取出幼胚或种子用于接种。火焰灭菌具有简便、快速、经济、彻底之优点。 高温高湿环境中生长的外植体或易感染病毒的外植体的深灭菌处理 因这类外植体不仅表面滋生大量的微生物，