药敏试验、血凝与血凝抑制试验.docVIP

药物敏感试验 [目的要求] 1. 相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，筛选最有疗效的药物，指导临床合理用药控制细菌性传染病和预防耐药菌株的流行。 2. [材料与试剂] 1. 实验材料： 1.1 普通营养琼脂培养基：做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基；做沙门氏菌可选择血清培养基。本试验选用普通营养琼脂培养基。 1.2 药敏试纸：购买成品或自制（详见实验准备）本实验选用成品：丁胺卡那霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素、痢特灵、头孢肤肟、奥复星、菌必治、复方新诺明。 1.3 细菌：待做药敏试验的细菌本试验选用大肠杆菌。 1.4 接种环、酒精灯、恒温培养箱。 2. 实验准备： 2.1 药敏片的准备：购买成品或自制。 2.1.1 药敏片的制备：取1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经℃，15-20min高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。 2.2.2 抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。 2.2 药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。 2.3 普通琼脂培养基的制备（也可使用成品的营养琼脂）：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml。 [实验内容及操作方法] 1. 在超净工作台中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密） 2. 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴片），每种药敏片的名称要记住。 3. 将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。 4. 结果观察：在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。 5. 判定标准：药敏验的结果，应按抑菌圈直径大小（mm）判定敏感度高低[注意事项] 1. 培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。 2. 细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。 3. 药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。 4. 培养时间：一般培养温度和时间为37℃ 8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2-4，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。血凝及血凝抑制试验 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂] 1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50(L定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液新城疫病毒液（尿囊液或冻干