Sanger法测序.ppt

引物稀释 干粉稀释 Step1：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓度应加入的超纯水； Step2：将干粉离心12000rpm， 2min； Step3：加入一定体积的millipore水后盖好离心管盖； Step4：振荡1分钟，室温放置30分钟，使其充分溶解； Step5：再次振荡30秒，离心10秒。 引物稀释 液体稀释： 根据以下公式计算（通常使用液浓度＝3.2pmol/μL） 加水量=(储存液体积×储存液浓度/使用液浓度)-储存液体积 按预算的体积在1.5mL离心管中加入millipore水，吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振荡30秒，离心10秒，备用。 稀释引物注意事项 1、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm离 心30s,干粉引物12000rpm离心2min。 2 、打开干粉引物离心管盖时动作尽量轻缓，打开的角度不超过45°。 3、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。 4、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污染。 5、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一一对应写在新的Ep管上。 back 反应加样 按《测序反应表》将待测样本和测序引物摆放到96试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板号后开始加样。 按照反应体系加样： 每次加完后都要离心一下，检查每个孔是 否都已加入，然后才 进行下一步 A、B位点用1/27体系 DR位点用1/20体系 1/27体系 ： 1/20体系： 模板 1.0 μL 模板 1.0 μL Bigdye（2.5×） 0.3μL Bigdye（2.5×） 0.4μL 5×buffer 0.85 μL 5×buffer 0.8μL Primer（3.2p） 1.0 μL Primer（3.2p） 1.0 μL 去离子水 1.85 μL 去离子水 1.8μL ------------------------------------- -------------------------------------------- 5μL 5μL 加样时注意事项： 1. 使用前检查移液器量程设定是否准确； 2. 使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内不能有残留； 3. 在距管口3-5毫米处贴管壁加微量试剂. 加样时注意事项： 4. 加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足，确认无误后方可进行下一步操作； 5. 加错试剂时立即在测序反应表中记录，在新的板孔中重新加样； 6. 加不同试剂或相同试剂加入含有不同试剂的板孔 中，必需换枪头； back 上PCR仪： 1. 短暂离心后上PCR仪。 2. 测序反应程序： 96℃，2min→｛96℃，10s→55℃， 5s→60℃，2min｝×25cycles→15℃，∞； 3. PCR仪程序运行结束后冷却到15℃，退出程序，取下测序反应板，记录PCR仪运行情况；在纯化板左边画上“√”代表已上PCR仪；冰箱冷藏区特定位置保存，待纯化，并通知纯化岗同事。 上PCR仪注意事项： 1.上机前确认样品板的孔都加了样品； 2.确认PCR程序是否正常终止； 3.程序结束后，观察每孔是否有蒸干现象； 4.连续使用PCR仪时，两轮之间让机器待机20分钟以上。 back 测序检测所用的3730XL 测序峰图的简单分析 我们所用的峰图分析软件为： Sequence Scanner V 1.0 整板峰图的大概情况： 原始数据Raw窗口： 原因：1、模板质量差；2、模板浓