牛病毒性腹泻病毒NADL株囊膜糖蛋白E,2基因的克隆与序列鉴定.pdf

摘 要 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，是世界范围内导致产生牛病毒性腹 泻一粘膜病的瘟病毒属病原。BVDV基因组包括一个正的单链RNA，编码 所有的结构蛋白和复制成分。基因组的前半部分翻译一个多聚体蛋白， 蛋白中，E。蛋白被认为是与中和作用有关的囊膜蛋白。因此，对BVDVE： 基因进行克隆具有重要的生物学意义。 BVDV NADL株属于致细胞病变型毒株，用MDBK细胞培养增殖BVDV， 经5—6次连续传代至出现明显的细胞病变。收集细胞培养液，并浓缩 E。基因序列，根据其同源性用生物学软件Primer5设计引物，并在引 I和Nco 物的两端加入Bal I两个酶切位点，酶切位点的存在易于对 E。基因进行克隆操作。 在基因组RNA的提取和E。基因的反转录过程中，所用试剂全用 DEPC处理水配制。通过RT—PCR扩增E：基因，电泳测定扩增片段的大 转化E·coli JMl09，经蓝自斑筛选，挑取阳性克隆，提取质粒，直 接电泳鉴定和酶切鉴定。通过对pBNE2PI E2基因的进一步基因序列和 核苷酸序列分析，结果表明，E。基因包括约1ii0个碱基，编码约370 个氨基酸。 本实验通过引物设计及BVDV囊膜糖蛋白E2基因的克隆，为E。基因 的进一步分子生物学分析及亚克隆奠定了的基础。 关键词：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2基因 引物设计分子克隆 致 谢 本论文是在导师崔保安教授悉心指导和亲切关怀下完成的。衷心 感谢恩师三年来的谆谆教诲，在生活、学习和工作中给予支持和帮助。 恩师高尚的思想修养、渊博的知识、严谨的学风和开拓进取的精神使 我受益终生。在论文完成之际，谨向恩师致以崇高的敬意和衷心的感 谢! 衷心感谢卢中华教授、王泽霖教授、t)ll庆教授、尹凤阁教授、 王自振教授在学业上给予的指导和帮助! 衷心感谢牧医工程学院及研究生处各位老师、领导的支持和帮 助! 非常感谢河南省农业科学院张改平研究员、阎玉河老师、陈占宽 老师等在理论和技术上的指导和帮助! 非常感谢郑州牧业工程高等专科学校李文刚教授、唐桂芬老师、 王岩师兄的支持和帮助! 感谢河南农业大学牛业工程研究所王学斌老师、杨明凡老师、张 素梅老师、王莉、徐端红三年来给予的热诚帮助! 感谢南京农业大学魏占勇博士、师弟胡涛、祁小乐、刘占通、金 喜新，师妹王丽娟、牛春玲给予的热情帮助! 感谢同学巩霞、黄娟、刘岩、刘红亮、罗俊、赵朴、苏丽娟、张 建英、胡秀丽三年来在生活上和学习上给予的关心和帮助! 最后，特别感谢父母朋友和家人多年来对我的的支持与关怀! 文献综述 1．1牛病毒性腹泻病的流行病学特征 Viral 牛病毒性腹泻／粘膜病(Bovine Viral Diarrhea 牛病毒性腹泻病毒(Bovine Virus，BVDv)感染牛引 起的以发热、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种 原性的同种病毒n3，1971年由美国兽医协会将其统一命名为“牛病毒 性腹泻／粘膜病”。BVD／如呈世界性分布，在许多养牛发达国家，如美 国、新西兰、加拿大等尤其严重乜3。1980年李佑民首先证明我国也有 本病存在。1。自80年代以来，我国已有15个省、市、自治区具有该 病的报道，此病感染动物包括牛、羊、猪、骆驼、鹿等H“，而且其致 病机理与临床类型也较为复杂。 —1％的牛具有持续性病毒血症。妊娠牛60-160天感染BVDV，因胎儿 免疫系统还未健全而引起免疫耐受，出生后即成BVDV持续感染牛(PI 牛)订3。这些牛死亡率很高，幸存牛可通过鼻涕，唾液，尿液、眼泪 和乳汁不断向外界排毒，是BVDV传染的主要来源。对BVDV