现代免疫学技术解析.ppt

第十五章 现代免疫学技术 第一节 免疫微粒技术 免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫微粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。 作为载体的微粒通常是以某种高分子有机单体为原料经过高分子聚合方法制备而成。 由于制备材料及工艺不同，现已制成惰性微粒、活性微粒、磁性微粒及标记微粒等四大类微粒，数量多达几十种。 将制备好的微粒与抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等方法形成免疫微粒，广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别等。 近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA的分离及PCR等研究领域亦显示出广阔的应用前景。 胶乳微粒免疫检测技术 胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原进行精确的定量测定。 根据特异性抗体致敏的胶乳微粒，与待测标本中的相应抗原相遇时发生凝集反应，胶乳凝集程度与被测物的浓度呈函数关系，由此可测出标本中待测物的含量。 测定方法主要有粒子计数法和浊度法两种。 免疫磁性微粒分离与纯化技术 磁性微粒(MMS) 是以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。 经过特异性抗体包被制成免疫MMS，与检样中的抗原结合形成免疫MMS—靶分子(或靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的免疫MMS，即可获得纯化的靶分子或细胞。 免疫微粒技术 免疫磁性分离原理示意图 基因工程α-2b干扰素的免疫磁性分离系统的开发 第二节 免疫组织化学技术 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。 免疫组化技术由免疫荧光技术逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。 免疫组织化学的全过程包括： 抗原的提取与纯化； 免疫动物或细胞融合； 制备特异性抗体以及抗体的纯化； 将显色剂与抗体结合形成标记抗体； 标本的制备； 免疫细胞化学反应以及呈色反应； 观察结果。 免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体(或抗原)作为探针，对检测待测组织、细胞标本中的靶抗原(或抗体)，进行定位、定性和定量的目的。 免疫酶细胞化学技术 免疫酶技术就是用酶标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、产生显色反应，识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。 免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，为免疫病理研究开辟了一条新途径。 另外，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察 抗体与靶抗原结合之后，形成的抗原抗体复合物在显微镜下是不可见的，如将抗体与某种显色剂偶联，抗原与抗体结合形成的复合物就由不可见而成为可见，从而可以确定组织中是否存在某种抗原。 第三节 免疫电子显微镜技术 免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM)是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。 特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。 免疫电镜技术常用标记原理 I 铁蛋白标记 铁蛋白是一种含铁23％，分子量约750kDa，直径为12—14nm的球形蛋白。 其核心是由4个亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶态分子团，外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形的外壳。 在电镜下，铁很容易和其他粒子相区别，显像清晰。可通过双功能交联剂可与抗体、SPA等共价结合；用于免疫电镜检测的优点是标记物呈颗粒状，分辨率高。 但其缺点是Fe的分子量太大，难以透过细胞膜和组织，只适用于细胞表面抗原定位；而且Fe染色标本只适合电镜检查，不能用普通光学显微镜观察。 酶标记 将酶标抗体用于免疫组化技术，以HRP标记抗体，通过H2O2／DAB底物系统被酶分解的呈色反应，来显示抗原抗体反应部位。 DAB分解产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过OsO4处理后变黑，具有高电子密度