南医生化实验报告2资料.docVIP

生物化学实验报告 一、实验目的实验原理材料与方法（1）质粒DNA的提取—碱裂解法 PCR基因扩增 紫外光吸收法定量检测质粒DNA 酶切鉴定 （5）琼脂糖凝胶电泳 四、结果与讨论 加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6-8次。13000rpm离心10min，小心取上清液（700μl ）； 加入250μl 溶液S2，颠倒4-6次温和混匀，直到溶液变得清亮； 向菌液中加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮； 向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液； 加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液； 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液； 空柱13000rpm离心1min，然后开盖室温放置3min，使残留乙醇挥发； 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中心上方垂直悬空加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min 再次向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液； 13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， 保留备用。 取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪加入4.5μl灭菌去离子水； 加入12.5μl 2×Premix Taq； 加入1.5μl引物1-SO100 (10mol/L)； 菌液煮沸10min, 冷冻，室温解冻后离心取上清； 将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心； 加入5μl菌液； 加入1.5μl引物2-SO101 (10mol/L)； 将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。 取2μl质粒DNA溶液，加入UVette比色皿中，并与98μl灭菌的去离子水充分混合，测量并记录数据； 打开紫外分光光度计，在UVette比色皿中加入98μl灭菌的去离子水，调零； 重复上一步骤2次，测量并记录数据。 取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪加入9.0μl去离子的无菌水； 加入2.0ml 10×R+BSA酶切缓冲液； 加入7.0μl质粒DNA； 混合均匀后，37℃ 水浴1.5h。 加入1.0μlHind III (15U/ul) 加入1.0μlEcoR I (12U/ul) 电泳板放入电泳槽； 胶床准备； 铺胶； 凝胶准备； 上样：每排样品孔预留第一个孔，加DNA Marker5000； 第一孔：5 μl 质粒DNA + 1μl 6×loading buffer混匀后上样； 加电泳缓冲液； 第二孔： 5 μl 酶切产物 + 1μl 6×loading buffer混匀后上样； 第三孔： 5 μl PCR产物直接上样； 拍照。 电泳；