猪microrna-124过表达载体构建及稳转细胞株建立.pdfVIP

Online system: 农业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2013, 21(11): 1396~1402 DOI: 10.3969/j .issn.1674-7968.2013.11.018 研究资源 Resources 猪microRNA-124 过表达载体构建及稳转细胞株建立 杨松柏 余璐纯 刘向东 李新云 樊斌 赵书红* 华中农业大学，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉430070 * 通讯作者，shzhao@ 摘 要 microRNA- 124(miR- 124)丰富表达于脑组织中， 控神经细胞分化，同时在肿瘤组织中，miR- 124还参与 控肿瘤细胞的增殖。分析表明，猪miR- 124 的前体序列位于4 号和14号染色体中。本研究 从长白猪(Sus scrofa )DNA 因组中扩增miR- 124 的前体序列，连接到T 载体中，再经过EcoR 和Not 双 酶切T 载体，回收相应的酶切片段，将酶切片段连接到PiggyBac(PB)转座子载体中，然后将重组载体(PB- miR- 124a1, PB-miR- 124a2)转染猪肾细胞系PK 15细胞，通过绿色荧光蛋白的表达检测转染效率，用嘌呤 霉素进行稳转细胞的筛选，最后通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定细胞内miR- 124 的表达活性。结 果显示，成功构建了重组转座子载体PB-miR- 124a1 和PB-miR- 124a2，观察绿色荧光蛋白的表达，显示转 染效率较高；稳定筛选的最佳嘌呤霉素的浓度为2 g/mL 。qRT-PCR 结果显示，和对照组相比，稳定转染 PB-miR- 124a2 组miR- 124 的表达显著升高(P ＜0.01)，而转染PB-miR- 124a1 组miR- 124 的表达升高不显 著(P=0.06)，说明miR-124 的本底表达 要来源于ssc-mir-124a2 因。本实验为研究猪miR-124功能机制 提供了 础材料。 关键词 microRNA- 124(miR-124) ，猪肾细胞系(PK15细胞) ，载体构建，嘌呤霉素 Construction of Porcine microRNA- 124 Overexpression Vector and Establishing of Stable Transfected Cell lines YANG Song-Bai YU Lu-Chun LIU Xiang-Dong LI Xin-Yun FAN Bin ZHAO Shu-Hong* Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Ministry of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China * Corresponding author, shzhao@mail.hzau .edu .cn Abstract microRNA- 124(miR- 124), high expression in brain, regulate neuronal differentiation and the pro- liferation of cancer cells. The porcine miR- 124 precursor is transcribed from chromosome 4 and 14. In this study, the miR- 124 precursor was amplified by PCR from landrace genomic DNA, ligated into T vector, then digested by EcoR and