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纤维素酶发酵 汪其林 维素酶发酵 纤维素酶是一类能水解纤维素成简单糖的复合酶，它主要包括葡聚糖内切酶（EG）、葡聚糖外切酶（CBH）和 β-葡萄糖苷酶（BG）。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 纤维素酶的分离纯化 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 以稻草粉和麸皮为主要原料，对白腐菌（White-rot fungi）NS75、黑曲霉（Aspergillus niger）NS83 和絮凝酵母（Saccharomyces cerevisiae）SP5 混合菌固态发酵产纤维素酶进行研究 单菌发酵生产的纤维素酶存在个别酶活低和酶系不完整的缺陷。 如，绿色木霉以及其近源的菌株发酵生成的纤维素酶中普遍存在着 β-葡萄糖苷酶偏低的缺陷。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 来自不同菌株的纤维素酶酶系不一样，通过混合菌发酵培养能够弥补菌株间的不同，生成各种有着不一样功能的混合酶，它们可以通过作用在纤维素的不同位点来发挥各种酶之间的协同作用，从而可以大幅度的提高纤维素酶的活性。 黑曲霉产 β-葡萄糖苷酶能力较高，但产内切和外切葡聚糖酶能力较低；白腐菌产内切酶能力较高。选用白腐菌NS75和黑曲霉NS83 在稻草粉、麸皮为主要培养基的基础上进行固态混菌发酵生产纤维素酶 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 在白腐菌和黑曲霉混合发酵产纤维素酶的基础上，接入絮凝酵母消耗发酵过程中酶解形成的纤维二糖、葡萄糖等简单糖对多菌固态发酵产酶的作用，实验考察了三菌混合发酵产纤维素酶的能力和主要酶种活力，并对发酵条件进行优化。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 1.固态发酵培养 将在斜面上培养 2-5d 的白腐菌、黑曲霉菌和絮凝酵母菌，分别制成约 107个/mL 的孢子或细胞悬浮液。分别取 1mL 接于 50mL 液体种子培养基中，于30℃、200r/min 培养 24h，白腐菌和黑曲霉双菌发酵接种 6mL 于含有 10g 固态发酵培养基的 250mL 的广口瓶中；三菌混合发酵则保持接种总量 6mL，白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母按 1:2:1.5（v/v/v）比例接种，接种后搅拌均匀，30℃恒温培养 5-7d，单因素实验每组 3 个平行。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 2.单菌、双菌与三菌混合发酵产酶情况对比 单菌发酵分别将 6mL 白腐菌或黑曲霉孢子液接入到装有 10g 稻草粉、麸皮发酵培养基的 250mL 广口瓶中；双菌混合发酵则将白腐菌孢子液和黑曲霉孢子液按 1:2 体积比接种；三菌混合发酵则以白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母按 1:2:1.5体积比接种，接种总量保持 6mL。接种搅拌均匀后放于培养箱中 30℃恒温培养发酵 8d，从第 3 天开始每天取平行样三瓶，分别检测其 CMCase 酶和 β-G 酶活。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 黑曲霉NS83 产 β-G 酶能力较强，在培养第 5 天时酶活达到 15254U/g，但产 CMCase 较弱，酶活为 7063U/g。白腐菌NS75 产 CMCase 能力较强，在培养第 5 天时酶活达到 11188U/g，但产 β-G 酶能力较弱，酶活为 6991U/g。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 双菌培养时在第 5 天酶活达到峰值，其 CMC 酶活为 17894 U/g，β-G 酶活为 22325U/g，比单菌发酵有明显提高三菌混合培养时，在第 7 天酶活达到峰值，其 CMCase 酶活和 β-G 酶活分别为 30099U/g和 54326U/g；相较单菌、双菌发酵，三菌混合发酵产生的纤维素酶酶活更高，发酵产酶时间延长，且比较稳定 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 其原因可能是接入絮凝酵母混合发酵后，消耗了可发酵的简单糖，有助于降低培养基中葡萄糖、纤维二糖等对发酵菌纤维素酶合成代谢的反馈抑制作用，使得产酶菌处于更有利的环境下生长和代谢产酶。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 2. 变温控制 混合菌按白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母=1:2:1.5 比例接种，接种总量 6mL。采用变温发酵，考查温度对混合菌发酵产酶的影响。实验温度控制按以下 5 种方式进行：①先 30℃3 天后 28℃4 天②先 30℃4 天后 28℃3 天，③先 30℃3 天后 35℃4 天④先 30℃4 天后 35℃3 天⑤一直 30℃培养 7 天，检测测酶活，结果如图 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 温度控制方式⑤所产的纤维素酶活较高，即温度一直保持在 30℃时酶活较高。表明温度震荡可能是对白腐菌、黑曲霉和絮凝酵母协同发酵产纤维素酶产生不利影响。 三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化 3.混合菌接种比例对产酶的影响 接种比例为 1:2:1.5 时，发酵产纤维素酶活相对较高。原因可能是在接入絮凝酵母混合发酵后，消耗了可发酵的简