光学显微镜讲解.ppt

THANK FOR YOUR ATTENTION * 荧光分自发性荧光（原发荧光、固有荧光或自然荧光）和续发性荧光。 　一、激光扫描共聚焦显微镜工作原理 　　激光扫描共聚焦显微镜的光源是激光，如氩离子、氪氩和氦氖等激光管产生。激光束通过入射针孔被聚焦成束斑落在样品的某一平面上，避免了非照射区域发生光散射，同时通过机械式对样品进行四维扫描；样品在被扫描时，产生反射的激光束或荧光，由原来的入射光路直接回到光束分散器，并经过在探测器的前方于焦点水平面的检测针孔及聚焦透镜到达探测器内。后者通过光电效应把光信号转换成电信号，最后传递到彩色显示器上，和进入计算机图像分析系统，对图像进行二维或三维的分析处理等 由于入射针孔和检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭、并几何尺寸一致；即光点通过一系列透镜，最终可同时聚焦于两针孔，这就是“共聚焦”的含义所在。经过这样的作用使样本中高于或低于聚焦平面的反射光和杂散光均被遮擦掉，从而提高图像的分辨率，使图像的质量更清晰 荧光显微镜 汞灯 发射滤片 激发光圈 目镜 激光光源 发射针孔 激发针孔 PMT 发射 滤片 激发滤片 激光扫描共聚焦显微镜 物镜 物镜 激发滤片 显微镜：倒置研究级全自动生物显微镜 配正置、倒置物镜各一套；恒温、二氧化碳培养系统；显微摄影数码相机 激光光源： 紫外激光器 UV 351/364nm； Red（HeNe633nm/10mw）； Green（HeNe543nm/1.2mw）; Blue（Ar 458nm/5mw；476nm/5mw； 488nm/20mw；514nm/20mw） HP-P4 2.0工作站 内存1.0G，光盘刻录机；Control、3D、Physiology软件； Leica TCS-SP2 激光扫描共聚焦显微镜 二、激光扫描共聚焦显微镜技术性能 （一）分辨率高：是普通显微镜的1.4~3倍 （二）灵敏度高：可检测极弱的荧光 （三）扫描方式多、扫描速度快 （四）扫描范围大：2cm×2cm （五）图像质量高并存取方便 （六）光切片和细胞CT：最薄平面间隔为 600~800nm，可观察片厚达0.5~1mm 的标本 （七）对细胞物质和结构的荧光能进行定位、 定性和定量分析检测 The UV and Visible Spectrum (Human Sight) 蛋白质标记用荧光探针 FITC 488 525 PE 488 575 APC 630 650 PerCP? 488 680 Cascade Blue 360 450 Coumerin-phalloidin 350 450 Texas Red? 610 630 Tetramethylrhodamine-amines 550 575 CY3 (indotrimethinecyanines) 540 575 CY5 (indopentamethinecyanines) 640 670 探 针 激发波长 发射波长 Hoechst 33342 (AT rich) (uv) 346 460 DAPI (uv) 359 461 POPO-1 434 456 YOYO-1 491 509 Acridine Orange (RNA) 460 650 Acridine Orange (DNA) 502 536 Thiazole Orange (vis) 509 525 TOTO-1 514 533 Ethidium Bromide 526 604 PI (uv/vis) 536 620 7-Aminoactinomycin D (7AAD) 555 655 核酸标记探针 探 针 激发波长 发射波长 离子标记探针 INDO-1 350 405/480 QUIN