4.1酶工程教案分析.ppt

第四章 酶工程 第二节 酶的分离纯化技术 酶的分离纯化应注意的问题： 温度（0~4℃） pH（酶的pH稳定性和溶解度） 盐浓度 搅拌（避免剧烈搅拌和产生泡沫） 微生物污染 溶解度大 分离效果好 不易引起变性 价格便宜 四、膜分离 五、层析分离 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水相互作用层析 …… 实例：脂肪酶的分离纯化 制备修饰酶的目的： 提高酶活力 改进酶的稳定性 允许酶在一个变化的环境中起作用 改变最适pH或最适温度 改变酶的特异性使它能催化不同的底物 改变催化反应类型 提高催化过程的反应效率 杂交酶（杂合酶）：指利用基因工程将来自两种或两种以上的酶的不同结构片段构建成的新酶。 三、生物酶的人工模拟 抗体酶：具有催化活性的抗体 印迹酶：利用分子压印技术制备的酶 （1）分子印迹酶 （2）生物印迹酶 酶反应器：以酶为催化剂进行反应所需要的设备 生物传感器：对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。是由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统 思考题： 1、盐析沉淀法的基本原理和操作过程？ 2、凝胶过滤与离子交换层析的原理与过程？ 3、酶的固定化方法有哪些？ 利用小分子或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰 部分水解酶蛋白的非活性主链 酶辅因子的置换 酶分子修饰常见的方法有： 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些细微的变化，从而改变酶的功能与特性。 常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。 提高酶活：每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合时，酶的活力可提高5.1倍。? 提高稳定性：在酶的外围形成保护层，使酶的空间构象免受其它因素的影响。 增强抗酸碱和抗氧化能力：木瓜蛋白酶与右旋糖酐结合 1、大分子结合修饰（大分子结合法） 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变。 酶分子修饰的金属离子：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、 Fe2+等。 方法： 酶液体中加入金属离子螯合剂（EDTA），通过透析、超滤等将EDTA金属螯合物除去，再将其它的金属离子加到酶液中与酶蛋白结合。 如：用Ca2+将锌型蛋白酶的Zn2+ 置换，酶活力提高20％～30％ 2、金属离子置换修饰 氨基修饰、羟基修饰、胍基修饰、巯基修饰、酚基修饰等 3、侧链水解修饰 利用肽链的有限水解改变酶的特性和功能。 如：用胰蛋白酶将天冬氨酸酶羟基末端的10多个氨基酸残基水解除去，可使天冬氨酸酶的活力提高4～5倍以上。 4、侧链基团修饰 二、酶的蛋白质工程 利用蛋白质工程对酶蛋白进行改造 三维结构 新蛋白质设计蓝图 蛋白质 利用 产物 基因 分子模型 X射线晶体衍射 DNA突变 克隆与表达 开发 酶的固定化 细胞的固定化 第六节 酶的固定化 什么是固定化酶？ 水溶性酶 水不溶性载体 水不溶性酶 （固定化酶） 固定化技术 酶在溶液中不稳定，容易变性失活；酶在反应后难以回收，不能重复利用；生产不能以连续方式进行；酶与产物混合在一起，增加产品分离纯化的难度，从而导致生产效率下降，成本上升。 1、酶的固定化 固定化酶：指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 可保持酶的催化特性，可克服游离酶的缺点。 游离酶的缺点： 固定化酶的优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。 酶的固定方法： 载体结合法 共价交联法 包埋法 物理吸附法：利用具有活泼表面的固相载体吸附酶。 如：石英砂、活性炭、高岭土、淀粉、硅胶等 离子吸附法：利用离子键使酶与载体结合从而固定。如：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等 螯合法：利用螯合作用将酶直接螯合到表面含过渡金属化合物的载体上。如钛（四价）和锆（四价）的氢氧化物，能与酶的羧基、氨基和羟基结合 共价结合法：通过共价键将酶的非必须基团与载体表面的反应基团结合，从而将酶固定。 如：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等 （1）载体结合法：将酶结合在非水溶性载体上。 常用交联试剂：戊二醛。 （3）包埋法：将酶包埋在高聚物凝胶网格中或高分子半透膜内的固定方法。 酶不会扩散到周围介质中，而底物和产物却能自由出入。 包埋剂：琼脂、海藻酸钠、明胶、淀粉等。 （2）共价交联法：通过双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和载体间形成共价键的链接方法。 载体 化学原料合成 ：树脂类物质 天然材料制成： cellulose、sephadex、 sepharose 电荷基团 阳离子交换剂: 电荷基团（－）, 反离子（＋）