鸡球虫3-1E和CDPK基因工程苗的研制及其免疫保护效果.pdf

中文摘要 球虫病是熊害养禽业的一类严重的寄生虫病，在抗球虫免艘反应中。细胞免疫反应所起的作 用要大于体液免疫的作用，为了研究核酸疫苗和重组蛋白疫苗对鸡球虫病的防治效果，进行了以 下试验： 1．球虫子孢子表面抗原基因(3-1E、CDPK)的克隆：分别以E．tenellaGs和E．acervulind QH pGEM-T Et GS 3-IE与文献报道的点a 3一lE同源性为99，6％，Ea 3-1E与文献报道的点口3．1E同源性为 QH 99．2％，EtGS 3-1E与EaQH 码490个氪基酸，与文献报道的EtCDPK同源性为99，6％。 2．基因的表达与纯化：按照pGEX．6PI表达载体的多克隆位点，重新设计添加相应酶切位点 接，将鉴定正确的阳性菌落转化其宿主菌BL21进行诱导表达。并将表达产物通过GST纯化柱进 达的融合蛋白均为可溶性蛋白，将超声裂解后的上清直接过柱纯化，得到了高纯度的重组蛋白。 染入BHK细胞，收集对数生长期的细胞，提取细胞的总RNA，反转录之后使用特异性引物进行 PCR扩增，检测质粒在细胞中的转录情况，琼脂糖电泳检测到各自的特异性条带，说明peE和 pcC真核重组质粒可在真核细胞中诱导表达蛋白。 4．真核表达质粒和重组蛋白的免疫原性研究及体内表达检测：采用MTT法对构建的真核表 达质粒和重组蛋白进行了淋巴细胞转化试验，研究表明，在一免后7天，各免疫组淋转水平均有 不同程度的提高，在二免后7天和感染质7天。各免疫组淋转水平有显著性提高．说明随着免疫 时间的延长及加强免疫后．各免疫组具有较强的诱导鸡的细胞免疫反应的能力。通过对poE和pcC一 免疫组肌肉组织基因组DNA的提取、总RNA的提取，反转录、PCR鉴定结果表明，核酸疫苗 至少可在体内存在并持续表达1个月。 5．真核表达质粒和重组蛋白对球虫感染鸡的保护研究：在每次核酸疫苗免疫鸡只前对注射部 位进行25％蔗糖的预处理，间隔一周两次免疫．二免后7天攻击3×104个由GS卵囊。7天后 杀鸡观察免疫组的保护效果。结果表明，免疫组与感染对照组相比，均可降低卵囊产量(50～80．71 到或接近中等(150．12～171．09)的抗球虫效果。 关键词：核酸疫苗，球虫．基因，克隆，表达 Abstract Aviancoccidioslsisall diseaseforthe orderto economicallyimportant poultryindustry．Instudy DNAvaccine chicken have conductedthe studies： against coccidiosis，we foIlowing 1．Clone totalRNA 3-1EandCDPICThe ofEimeriatenellaGallsu(EtGS)strainand ofgene Eimeria acervulina wasextracted andusedasthe for Qinshai(EaQH)strain separately template RT—PCR．111eEtGS3-1E andEa 3-IE werecloned using gene QH gene separatelyspecificprimers．