慢性应激致大脑皮层神经元蛋白质酪氨酸硝基化和凋亡关系研析.pdfVIP

慢性应激致大脑皮层神经元蛋白质酪氨酸硝基化 与凋亡关系的研究 研究生：吕保来 导 师：吴爱群 教授 何 成’ 教授 实验指导：曹 莉+ 副教授 郑州大学医学院人体解剖教研室郑州450052 ’上海第二军医大学神经生物教研室上海200433 中文摘要 研究背景 慢性应激是有害于身体健康因素之一。许多疾病与应激有关，如抑郁症、情 感障碍等“1，慢性应激影响神经突触的重塑，突起的形态和神经发生等…。慢性 应激后通过各种病理机制途径导致大脑神经元损伤，特别是大脑皮层和海马神经 元尤为损伤明显。其机制之一是大脑神经元产生过量的一氧化氮与超氧离子反应 形成超氧硝酸根离予。虽然慢性应激NO”和N旷引起神经细胞损伤的机制已有研 究，但慢性应激损伤N02+和N03作用的转导途径，尚不十分明确。目前有关神 经元凋亡的研究大多集中在脑缺血、脑缺氧等方面，提示存在酪氨酸 硝基化现象。然而，有关慢性应激后神经元凋亡研究甚少，特别是酪 氨酸硝基化与细胞凋亡关系，亦未见报道。研究阐明慢性应激损伤N0“ 和NO”作用的转导途径以及酪氨酸硝基化与细胞凋亡关系，对于揭示慢性应 激神经元损伤的病理机制以及选用不同用药具有重要意义。 目的 1． 观测慢性应激大脑神经元蛋白质是否发生酪氨酸硝基化及其蛋白酪 氨酸硝基化神经元在大脑内的时间和空间分布。 2． 比较蛋白质酪氨酸硝基化与用Caspase一3和AIF作为标记的凋亡在时 间上的先后关系。 3． 观察注射抗诱导型一氧化氮合酶(iNOS)激活药物对蛋白质酪氨酸硝 基化和凋亡的影响。 我们通过免疫组织化学方法观察到蛋白质酪氨酸硝基化神经元在大脑内的 时间和空间分布。用免疫组织化学共定位的方法比较蛋白质酪氨酸硝基化与用 Caspase一3和AIF作为标记的凋亡在时闻上的发生顺序。：观察注射抗诱导型一氧 化氮合酶(iNOS)激活药物对蛋自质酪氨酸硝基化和凋亡的影响。这对予将来我 们研究由应激产生的神经元损伤病理机制以及选用不同用药具有重要意义。 方法 行行为学评分，选择评分相近的60只雄性sD大鼠，随机分为对照组、慢性不可 预见性应激组(CUS)和尿酸处理(UA)组。每组各20只，每组又按时间不同(0w、 1w、2w、3w)荐分飚个亚组，每亚组5只。 2．实验性慢性应激动物模型的建立：对照组5只／笼、慢性应激1只／笼。 应激组和尿酸处理组SD大鼠接受2l天各种不同的应激，包括电击足底、冰水游 泳、热应激、摇晃、夹尾、禁水、禁食和昼夜颠倒等。分别在实验前l天、实验 后7、14和21天测定动物体重和用。pen—fieldtest法进行行为学评分。用Nissl 染色法观察细胞形态和Go∞ri硝酸铅改良法测定酸性磷酸酶，在脑组织形态方 面进一步评价慢性应激模型的成功。 3．用酪氨酸硝基化抗体进行免疫组化染色来测定慢性应激后酪氨酸硝基化 神经元在大脑中的时间和空间分布，并用免疫印迹的方法来测定大脑皮层酪氨酸 硝基化蛋白质的大致分子量。用酪氨酸硝基化抗体与Casp8se一3和A王F抗体做免 疫组织化学共定位染色，比较其在时间上的先后关系。最后用抗iN。s药物尿酸 (淞)注射到慢性应激动物腹腔，与慢性应激组比较酪氨酸硝基化和Caspase一3 阳性神经元的变化。 结果 l。慢性应激组大鼠和对照组比较，体重增加(DO—D22)明显减缓(p0．01)。 行为学是以动物的自发行为为基础，能够反映动物整体的生活行为改变，如站立 不动，皮毛和头面部不洁，排便增多(急性应激可导致行为活动增加，慢性应激 ll 可导致行为活动减少)。慢性应激组大鼠和对照组相比，水平活动和垂直活动次 数、理毛时间均明显下降，等待时间显著延长，排便次数显著增多(P0．01)。 2．对照组大鼠顶额叶皮层神经元尼氏体清晰，神经细胞排列整齐，层次清楚： 慢性应激组大鼠顶额叶皮层神经元尼氏体脱颗粒，数量减少，神经细胞排