酶工程动植物细胞培养产酶.pptVIP

四、植物细胞培养产酶的工艺过程 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。 (2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。 (3)酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。 超氧化物歧化酶(S O D) ： 是催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶, 具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的功效。S O D 可以从动物、植物和微生物细胞中提取分离得到。 第二节 动物细胞培养产酶 动物细胞培养是在 20世纪50年代, 伊尔勒( Earle) 等人开始进行病毒疫苗细胞培养的基础上,于 20世纪60年代迅速发展起来的技术。 1967年 开发的适合动物细胞贴壁培养的微载体技术, 1975年 发明的杂交瘤技术, 有力地推动了动物细胞培养技术的发展。 已经在疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质的生产中广泛应用, 工业化生产达到20 000 L甚至更大的规模, 已经成为生物工程研究开发的重要领域。 1. 动物细胞的特性 (1) 在于没有细胞壁 (2) 动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍, 稍小于植物细胞的体积。 (3) 大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在, 在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性。 (4) 动物细胞的营养要求较复杂, 必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进5 % ～10 % 的血清。 2.动物细胞培养的特点 主要用于各种功能蛋白质的生产。 细胞生长速度慢。（需添加抗生素） 细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 反应过程成本高，产品价格贵。 大多数细胞具有锚地依赖性，宜贴壁培养；部分细胞可采用悬浮培养。 动物细胞培养基成分较复杂, 一般要添加血清或其代用品, 产物的分离纯化过程较繁杂, 成本较高。 原代细胞一般繁殖50代。 3.培养方法 (1)悬浮培养 来自血液、淋巴组织的细胞, 肿瘤细胞和杂交瘤细胞 (2)贴壁培养 存在于淋巴组织以外的组织、器官中的细胞（成纤维细胞、上皮细胞等）；采用滚瓶培养系统、微载体系统。 (3)固定化细胞培养（锚地依赖性和非锚地依赖性细胞；吸附法和包埋法） 4.培养基的组成与配置 动物细胞培养基的组分较为复杂, 包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。 首先配制各类母液,如100倍浓度氨基酸母液、1000倍浓度维生素母液、100倍浓度葡萄糖母液(溶解于平衡盐溶液)等;在使用前, 分别吸取一定体积的母液, 混匀得到混合母液,膜过滤除菌后,冷冻备用;使用时,取一定体积的混合母液,用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。 5.培养条件的影响与控制 （1）温度：一般控制在36.5℃，波动范围0.25℃. （2）pH值：一般控制在pH7.0-7.6的微碱性范围内（最优pH7.4）。 调节pH 值, 通常采用CO2 和NaHCO3 溶液；维持pH 值的稳定, 通常在培养液中加入缓冲系统；常用酚红监控p H 值（蓝红色为pH7.6, 红色为pH7.4, 橙色为pH7.0, 黄色为pH6.5）。 （3）渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 （4）溶解氧：根据情况随时调节。 6.动物细胞培养产酶的工艺过程 通过动物细胞培养获得的酶主要有胶原酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶等。现以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例, 说明动物细胞培养产酶的工艺过程及其控制。 工艺过程： 1. 人黑色素瘤细胞培养基（Eagle 培养基） 2. 人黑色素瘤细胞培养 (1) 将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理, 分散, 用p H 7. 4 的磷酸缓冲液洗涤, 计数, 稀释成细胞悬浮液。 (2)