家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析及表达及表达 毕业论文.docVIP

目 录 摘要 1 前言 3 1 材料和方法 4 1.1 材料及主要试剂 4 1.2 方法 4 1.2.1 引物设计 4 1.2.2 PCR扩增目的片段 4 1.2.3 目的片段的分离和回收（Takara回收试剂盒） 5 1.2.4 酶切反应 5 1.2.5 连接反应 6 1.2.6 感受态细胞制备 6 1.2.7 连接产物的转化 6 1.2.8 试剂盒抽提质粒DNA 6 1.2.9 重组质粒的鉴定及测序 6 1.2.10 原核表达 7 1.2.11 SDS蛋白电泳 8 2 结果 9 2.1 野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列克隆 9 2.2 野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列分析 10 2.3 Serpin-2重组表达载体酶切鉴定 14 2.4 蛋白质表达与SDS分析 15 2.5 Western Bloting分析 15 3 讨论 16 参考文献： 17 致 谢 18 附录1. 19 附录2. 20 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析及表达及表达 摘 要 本研究以家蚕中大造品种为材料，以其 cDNA为模板克隆家桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin-2基因；采用大肠杆菌原核表达系统（BL21）进行家蚕Serpin-2基因的表达研究。主要结果如下： 根据Serpin-2（GenBank登录号AF242200.1）序列设计bp，编码329个氨基酸，相对分子量约为43.75 kDa，等电点约为4.67。与家蚕Serpin-2比较发现，两者基因序列相似度高达99.29%，氨基酸序列相似度高达98.93%，推测家蚕Serpin-2与野桑蚕Serpin-2基因起着相同或类似的作用。 将家蚕大造Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，转化到大肠杆菌BL21中，经1 mmol/L IPTG诱导蛋白质表达。SDS电泳分析结果表明，经IPTG诱导转化家蚕Serpin-2的BL21菌与对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带，相对分子量约44 kDa，与预计的大小相符，证实家蚕Serpin-2在大肠杆菌中得到表达。 家蚕Serpin-2基因的成功克隆和原核表达研究为从分子水平上解析erpin在野桑蚕体内的功能打下了基础。 关键词：家蚕；Serpin-2；基因克隆；原核表达 Cloning and prokaryotic expression of Serpin-2 gene of Bombyx mori Abstract In this study，the gene of Serpin in Bombyx mori (Serpin-2) was cloned by PCR using the whole body cDNAs as templates. E.coli prokaryotic expression system was used for expression study of serpin-2 gene. The main results are as follows: According to the sequence of Bombyx mandarina serpin-2 gene, proper primer was designed and Serpin-2 gene of Bombyx mori（The GenBank accession numbers：AF242200.1）was cloned by PCR. According to sequence analysis, the bp coding region of Serpin-2 encoding 329 amino acid residues results in theoretical molecular weight of 43.75 kDa, isoelectric point of 4.67. Comparied to the Serpin-2 gene of Bombyx mori and Bombyx mandarina，the gene identity and amino acid identity reach 9.7%，respectively. It reveals that Serpin-2 of Bombyx mori and Bombyx mandarina may play a same or similar role. The Serpin-2 gene was constructed to the prokaryotic expression vector pET-28a（+） and then trans