第3核酸的结构与功能.ppt

+ + Py Py Py Py Py Py Pu Pu P P P P P P P P P P 2H2O （2）RNase （1）牛胰核糖核酸酶（RNase Ⅰ） 作用：嘧啶核苷3’－磷酸与其它核苷酸连键 专一性极高的内切酶 产物： 3’嘧啶核苷酸/其结尾的寡核苷酸 P P P P P P P 2H2O P P + + OH OH P P P P P G A G A A A G G C U U C （2）核糖核酸酶T1 （RNase T1） 作用：3’－鸟苷酸与相邻核苷酸5’－OH连键 产物：3’－鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸 （3）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ） 作用位点为Ap残基 可将tRNA完全降解为3’－腺苷酸结尾的寡核苷酸 ①DNaseⅠ：牛胰脱氧核糖核酸酶 Mg2+激活、柠檬酸盐抑制 切断双链或单链DNA ——以5’－磷酸为末端的寡聚核苷酸 ② DNase Ⅱ：牛脾脱氧核糖核酸酶 Mg2+抑制 ——3’－磷酸为末端的寡聚核苷酸 （3）DNase ③链球菌脱氧核糖核苷酸酶： 内切酶，作用于DNA 产物为5’－磷酸为末端的碎片 ④限制性内切酶(细菌) 主要降解外源DNA 具严格的碱基序列专一性 EcoRⅠ E：大肠杆菌E.coli属名 co：种名的头两个字母 R：大肠杆菌的菌株 Ⅰ：该细菌中已分离出的这类酶的编号 限制性内切酶通常与甲基化酶成对存在： 具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列。 甲基供体：S－腺苷甲硫氨酸 甲基受体：DNA上的A与C ——甲基化使细菌自身的DNA带上标记 5 ’-T-A-G-C-T-A- -T-A-G-C-T-A-3’ 3’-A-T-C-G-A-T- - A-T-C-G-A-T- 5 ’ 5 ’-T-A-G-C-T-A- -T-A-G-C-T-A-3’ 3’-A-T-C-G-A-T- - A-T-C-G-A-T- 5 ’ 非特异性的糖苷酶 碱基特异N－糖苷酶 水解糖苷键 （4）N－糖苷酶 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用 一、核酸的分离、纯化及鉴定 第4节 核酸研究方法 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。 DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇 1、DNA的提取 制备RNA时，最重要的是使RNase灭活： ①所有容器都要经过高温处理，不能高温高压的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。 DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性； ②加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活； ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin) 2、RNA的提取 （2）定糖法 RNA：核糖→ 糠醛→ →绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖+二苯胺→兰色物质（595-620nm） 苔黑酚/地衣酚 浓HCl 浓硫酸 （1）紫外分光光度法 1个A～50μg/ml 双链DNA ～40μg/ml RNA或单链DNA 3、核酸含量测定 （3）定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸 （4）琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物 在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 二、核酸的一级结构测定 末端终止法——Sanger 2’，3’双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。 MOV : MCB4.0\Dideoxy sequencing of DNA DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP 1．DNA双螺旋结构模型是_________于____年提出的。 2．核酸的基本结构单位是_____。 3．DNA双螺旋的两股链的顺序是______关系。 4．B型DNA双螺旋的螺距为___，每螺旋有___对碱基，每对碱基的转角是___。 5．维持DNA双螺旋结构稳定的主要因素是_____，其次，大量存在于D