蛋白质分离纯化主要方法.ppt

蛋白质分离纯化主要方法 蛋白质分离纯化的一般步骤 二 层析技术（chromatography）p148 （一）、层析技术原理 (二) 层析相关概念 1.固定相： 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 2.流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。 （三）、层析法分类（按分离原理分类 ） 层析法分类（按装置分类 ） 各类层析的原理和载体 吸附层析（absorption chromatography） 　原理： 　　　以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。 原理： 分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法 分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。 物质在纸上移动的速度可以用Rf表示： 色斑中心至原点中心的距离 Rf = ────────────── 溶剂前缘至原点中心的距离 凝胶层析（gel filtration） 又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、 凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。 原理p303 载体 葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose） 离子交换层析（ion-change chromatography） 原理 　　 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。 分类： 根据交换剂上吸附的离子交换基团不同， 阳离子交换剂; 阴离子交换剂； 按其解离度的大小， 分为强、中强、弱三种： 交换过程 亲和层析（affiuity chromatography） 原理 欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法称为亲和层析法。 聚焦层析（Chromatofocusing） pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。 1、pH梯度的形成 2、蛋白质行为 3、聚焦效应 几种主要层析方法比较 二 、 电泳技术 电泳的一般原理 电泳分类 （一）按原理分四种 1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。2.自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。 （二）按支持介质的不同可分为：　　1.纸电泳　　2.醋酸纤维薄膜电泳 　　 3.琼脂凝胶电泳 　　 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳　　5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。 （三）按支持介质形状不同　　 1.薄层电泳 ； ? 2.板电泳 ；? ? 3.柱电泳。 （四）按用途不同可分为：1.分析电泳；