一种能够用于降低有机磷杀虫剂残留的红色荧光标记的安全基因工程菌_new_new重点解读.docxVIP

? 一种能够用于降低有机磷杀虫剂残留的红色荧光标记的安全基因工程菌 ? 摘要： 为了有效地生物降解有机磷杀虫剂在自然界中的残留，我们构建了一种基因工程菌，它不仅能释放出红色荧光，还能降解有机磷农药的残留物，并且这种基因工程菌当被需要的时候也可以自杀。两种带有不同功能的基因被置于不同启动子的控制之下。一种基因是双基因表达载体pL-DsRed-pL-OPH，在这种基因中，编码DsRed和有机磷水解酶的基因被独立地定位于两个pL启动子下游。只要基因工程菌是活的，这些基因能够自由地表达。另外一个基因是条件型自杀质粒pDS，包含当他们探测到有果胶糖的时候，两个自杀盒被设计用来自杀。被用于自杀质粒的致死基因是灵感菌不带前导编码序列的核酸酶基因。这被置于T7启动子的控制下。在降低农药和污染方面，应用这种安全型的基因工程菌是一种潜在地带有更少危险性的环境策略。 ? 关键词：安全模型；基因工程微生物；自动荧光标记蛋白；监测；有机磷污染物；杀虫剂降解 ? 简介 ? 有机磷复合物（OPs）是一种广泛的毒害神经的化学物质，能够被用作杀虫剂或者战争手段。有机磷复合物的广泛应用造成了多种环境污染并越发引起人们对于杀虫剂残留的关心。能够降解有机磷复合物的基因工程菌的发展与应用将会成为降低有机磷复合物残留的有效方法。有机磷化合物水解酶（OPH）是一种发现于土壤微生物假单胞菌属小型菌MG和黄质菌属spp的有机磷三酯的水解酶类（Munnecke 1980）。OPH能够水解很多OPs，包括的底物有P-S键，并且是用于基因工程微生物降解有机磷农药残留的最普通的酶类。 ? ? 尽管有很多基因工程微生物，包括那些有能力降解有机磷农药并已经被构建的微生物，但是他们的利用，通常被面临释放它们到环境中的相关风险所限制，这些风险包括：来自基因工程微生物的基因从它们自身转移到其他生物体，并且相反地也面临本地微生物的潜在影响。为了降低这些风险，被设计释放进入环境的基因工程微生物必须能够被有效的监视，它们的分布必须被多种生物抑制系统所限制。 ? ? 最近，生物技术，如基因探针、PCR、单克隆抗体、自发荧光蛋白（AFPs）等已经被应用于监测基因工程微生物。通过这些，AFPs是唯一不需要条件底物、辅因子或蛋白质的技术。GFP，被发现于太平洋西北部的水母体内， DsRed，是一种发现于Discosoma sp珊瑚礁的红色荧光蛋白，在1999年被广泛应用于自发荧光蛋白（AFPs）。尽管很多含有绿色荧光蛋白的基因工程菌已经被构建起来，相对来说，很少有被构建起来去表达DsRed DsRed在某些方面更优于GFP---GFP对于光漂白有更大的抵抗力，对于pH范围为5-12的吸收和荧光有着极微小的pH独立性---DsRed有一个具有重要意义的红移荧光普段，它可以减少和细胞光分散及自发荧光相关的问题。这篇文章描述的是构建一种GEB，他能够发出红色荧光，降解有机磷复合物，同时能通过带有两种不同基因和启动子的质粒的相互转化来进行有效的生物限制。一种是携带DsRed和OPH的基因，它们被分开定位于两个lambdaPL启动子下游。其他的基因是亲和的条件型自杀质粒pDS，它包含灵感菌两个致死基因的复制子而没有前导编码序列。 ? 材料和方法 质粒的构建 ? ?已经添加两个附加终止密码子的基因DsRed，通过PCR从pDsRed-N1扩增，并且在质粒pBV220的限制性酶切位点EcoRI和BamHI处克隆。合成的质粒被称作pBVDsRed.编码蛋白质OPH的基因opd，从乔博士获得的pGEM-T Easy-opd基因的得到扩增。 PCR扩增的opd基因然后插入到质粒pBV220的限制酶切位点BamHI和PstI位点，以获得质粒pBV-OPH。设计引物来扩增整个pBV-DsRed和pBV-OPH的基因序列，除去在质粒pBV220转录调控中编码阻遏蛋白的基因cIts857.扩增的片段然后自我环化来构建质粒pL-DsRed和pL-OPH。然后整个pL-DsRed片段再一次扩增，同时和来自带有启动子序列、opd基因和rrnBT1T2启动子的基因pL-OPH的扩增片段连接在一起。最后组合的质粒被定名为pL-DsRed-pL-OPH。 ? 基因工程菌的构建 质粒pL-DsRed-pL-OPH和条件型致死质粒pDS相继被导入E.coli核酸链BL21-AITM中，它使用的是氯化钙法产生的基因工程菌。这种菌能够释放红色荧光，降解有机磷复合物，同时当被诱导的时候能够自杀。pDS是一种条件型质粒，它包含两个自杀基因盒。他们被设计成当监测到果胶糖的时候，它们就会诱导菌体自杀。应用于自杀基因的是S.marcescens的核基因，它不包含前导编码序列。它处于T7启动子的控制之下。BL21AI-ROS’s红色荧光和降解有机磷复合物的能力