第讲用于核酸操作的工具酶重点分析.ppt

* 核酸分析包括核酸的碱基序列、整合位点、基因多态性分析等。蛋白质分析包括氨基酸序列、分子量、分子结构、生物活性等。 细胞分析包括细胞抗性分析、细胞形态分析、体细胞培养分离鉴定等。营养成分分析包括主要营养成分分析、微量营养成分分析、抗营养因子分析等。功效成分分析包括具有保健功效的各种成分及含量的分析等。毒理学试验包括毒性、致敏性、致病性试验等。 功能学试验包括各种保健功能试验等。吸收利用试验包括动物、人体吸收利用试验。稳定性试验包括加工稳定性和贮藏稳定性等。 * * 镰刀型细胞贫血症患者珠蛋白Bs基因第6个密码子突变，可以应用限制酶MstII识别法予以诊断；通过限制性片段长度多态（RFLP）的连锁分析，可推测一个家庭成员和胎儿是否携带有遗传病，这一技术已成功应用于地中海贫血病、苯丙酮尿症等多种遗传病的基因诊断。 * DTT—二巯基苏糖醇 * * Pu表示嘌呤碱基A或G，Py 表示嘧啶碱基C或T。 * DNA平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多 * 粘性末端的连接在较低温度下为互补末端的退火连接，属于分子内的连接，而平末端则为分子间的连接，平末端的3’-OH与5‘-P相互碰撞的机会显著减少。 * DNApolI是由大肠杆菌polA基因编码的一种单链多肽蛋白，约有1000个氨基酸。 5‘→3‘的核酸外切酶活性:可以从5‘切割降解双链DNA，也可以降解RNA与DNA杂合体中RNA部分，每次可以切割多个核苷酸。起切除损伤的DNA、修复DNA的作用。 3‘→5‘的核酸外切酶活性：切割到有3’-OH的双链DNA或单链DNA，方向是3‘→5’，每次只能切割一个脱氧核苷酸。 * 5‘→3‘的核酸外切酶活性：要求待切除的核酸分子5‘具有磷酸基团，被切除的核苷酸必须是配对的， * 该酶首先由Klenow用枯草杆菌蛋白酶特异性降解DNA聚合酶I制备，因此用Klenow命名。 * * * * 从Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶 * * 反转录酶主要来源于鼠或禽反转录病毒。 * * TdT—末端脱氧核苷酰转移酶，一种不需要模板的DNA聚合酶， * * CIP在SDS中加热到68oC完全失活。 Taq DNA聚合酶的特性 B、 用途： 主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增4×106倍。 缺点：产物容易发生错配 原因：体外扩增缺乏纠正系统，碱基的错误掺入率比体内高。 体内的聚合反应错配率约为10-9，而体外Klenow酶催化的反应错配率高达10-4。此外，TaqDNA聚合酶缺乏校正功能，错配率比Klenow酶高4倍。 5、高保真DNA聚合酶： （1） pfu DNA 聚合酶：从Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶 具有3’5’外切酶活性。 无5’3’外切酶活性。 具有校正功能，使产物的碱基错配率 极低。 PCR产物为平端，无3端突出的单A核苷酸。 (2)Vent DNA 聚合酶 　该酶是从Litoralis嗜热球菌中分离出的，具有3‘-5’外切酶活性，可以去除错配的碱基，具有校对功能，但不具有5‘-3’外切酶活性。 5、依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶特性：以RNA为模板聚合cDNA链 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-18 反转录酶 Mg2+ dNTP 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 5’ 3’ RNA 3’ 5’ cDNA 反转录酶 5’ 3’ RNA 3’