基本实验技术详解.pptxVIP

基本实验技术;一 分子克隆;载体构建将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大肠杆菌，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而克隆基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。;慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在 HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或 RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。;转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。可通过转染干扰片段或过表达质粒，研究基因的作用。;实时定量 PCR (Real - Time Quantitative Polymerase ChainReaction) 是在经典 PCR技术基础上，通过在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用特定仪器检测荧光信号积累的强弱，进而实时监测每一轮 PCR 反应产物，并对与其产物量呈正相关的初始模板进行定量分析的技术。 ;? 绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 ? 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究;染色质免疫共沉淀（Chromtin Immuno Precipitation， CHIP）是目前唯一研究体内 DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。;CHIP实验技术流程图;蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。 该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。;四 病理实验;TUNEL细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组 DNA断裂时，暴露的 3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的 dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。是分子生物学与细胞形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡??体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡的形态特征。;IHC;五 细胞功能实验;细胞生长曲线;细胞迁移能力检测;Transwell小室;细胞划痕愈合;细胞侵袭能力检测;六 流式细胞术;流式检测细胞凋亡 Annexin V／PI双染法，在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征， Annexin V是一种分子量为 35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸检测凋亡早期细胞，PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜， PI拒染活细胞和早期凋亡细胞，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将 Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。;流式检测细胞周期;谢谢！