酶双水相萃取.pptVIP

LOGO 双水相萃取在蛋白质分离纯化中的应用 * Contents 1、双水相系统的形成 2、双水相系统的相图 3、蛋白质双水相萃取的原理 4、蛋白质双水相萃取的过程 5.蛋白质双水相萃取的优缺点 * 1.1、双水相萃取的形成的概述 熵增——混合——自发 分子间作用力——随着Mr的增加,而增大. 聚合物的不相容性——含有聚合物分子的溶液发生分相的现象. 形成原因 First Second Third * 形 成 过 程 当两种不同水溶性聚合物都溶于水中且浓度达到一定值时，体系会自然的形成互不相容的两相，两种聚合物分别溶于两相中，即构成双水相系统。这主要是由于聚合物分子的空间位阻作用，相互间无法渗透，而且有强烈的相分离倾向，在一定条件下即可分为两相。一般认为，聚合物水溶液的疏水性差异是产生相分离的主要推动力，且蔬水性差异越大，相分离倾向也越大。 形成条件 构成两相的溶质达到一定浓度 * 作用力为斥力 作用力为引力 作用力无强烈引力和斥力 形成双水相系统 形成两相，一相为两高聚物，一相为水相 完全互溶，形成均一相 双水相 均一相 两相 1.2、双水相系统中作用力的表现 * 1.3、几种常见的双水相体系 类　　型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物 非离子型聚合物/ 非离子型聚合物 聚乙二醇 葡聚糖 聚乙烯醇 聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮 高分子电解质/非离子型聚合物 羧甲基纤维素钠 聚乙二醇 高分子电解质/高分子电解质 葡聚糖硫酸钠 羧甲基纤维素钠 聚合物/ 低分子量化合物 葡聚糖 丙醇 聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 磷酸钾 硫酸铵 * 2、双水相系统相图 双水相区 单相区 临界点(critical point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如右图C点： 双节线 系线 * 3、蛋白质双水解萃取的原理 当蛋白质分子进入双水相系统后，由于其表面性质、电荷作用以及各种作用力（疏水键、氢键、离子键等）的存在，使其在两相间按其分配系数进行选择性分配。蛋白质主要分配在上相，菌体碎片在下相或界面上。 * 3.1、 蛋白质双水相萃取体系常用聚合物 无毒原则 聚乙二醇-葡聚糖 聚乙二醇-磷酸盐 * 3.2、影响蛋白质分配系数的因素 在很大的浓度范围内，被分离蛋白质的分配系数与浓度无关，而与被分离蛋白质的性质及选定的双水相系统的性质有关 两相的组成 温度、pH值等 两相溶液的比例 蛋白质的分子质量、电荷、极性 聚合物的分子质量、浓度、极性及离子的种类、浓度、电荷等 * 4、蛋白质双水相萃取过程 目的产物的萃取 PEG循环 无机盐的循环 主要有三部分构成： 匀浆液 ATPS PEG+盐 ATPS 上相（产物） 上相（PEG、杂蛋白） 下相（目的产物） 下相（废物） +盐 分离器 分离器 P E G 循 环 * 1）目的产物的萃取 细胞悬浮液经珠磨机破碎细胞后，与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进入离心机分相。通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质分配到上相( PEG相) ，而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相) 。 * 2 ）PEG的循环 在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG回收有两种方法：一种即前面所述的加入盐使蛋白质转入富盐相来回收PEG ，一种是将PEG 通过离子交换树脂，洗脱剂先洗出PEG，再洗出蛋白质。现在常用的方法是将第1步萃取的PEG 相或除去部分蛋白质的PEG相循环利用 。 * 3 ）无机盐的循环 一种方法是将含磷酸钠的盐相冷却到6 ℃，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种是用电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG 相的盐。双水相萃取所用的设备一般都是其他两相体系如水-有机溶剂体系所通用的设备，商业化的混合器-沉淀器系统以及离心分离机已成功应用于双水相萃取。用磁性分离等新技术也可提高两相分离。尽管刚开始应用时，大多数双水相萃取是间歇式的，但此技术更适合于错流萃取的连续生产，这样可有效利用空间和时间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、膜分离等相结合使用时。 * 4.1、蛋白质双水相萃取的工艺流程 Chart Title in here 2003 2004 2005 2006 30 0 70 120 * enzyme enzyme enzyme enzyme enzyme Enzymetic reaction substrate product 4.2、蛋白质双水相萃取与酶促反应 * enzyme enzyme enzyme Enzymetic reaction with ATPS * 5.1、蛋白质