蛋白质化学1详解.ppt

C端分析 ① 硼氢化锂还原法 ② 肼解法：也称联氨法 肼化物与苯甲醛缩合为非水溶性产物，离心除去，水溶性C端氨基酸用FDNB变成DNP氨基酸，用乙醚抽提、层析、鉴定 ③ 羧肽酶（carboxypeptidase, Cpase）法 最有效、最常用的方法 4种羧肽酶的来源和专一性 羧肽酶 来源 专一性 CpA 胰脏 能释放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸 CpB 胰脏 主要水解C端为Arg或Lys的肽键 CpC 植物或微生物 相当广泛，几乎能释放C端的所有氨基酸 CpY 面包酵母 可释放C端所有氨基酸 （2）肽链的拆开和分离 共价键：如二硫键，用过甲酸氧化、巯基乙醇还原 非共价键：蛋白质变性剂或高浓度盐处理 （3）肽链的部分水解 化学方法： 溴化氰（CNBr）裂解法: 专一裂解Met羧基形成的肽键 酶解方法 消化道几种蛋白酶的专一性 （4）肽段的分离和氨基酸序列测定 原理Edman降解法，自动测序仪 （5）找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列 （6）二硫键位置的确定 对角线电泳 （7）酰胺基位置的确定 样品蛋白质经硫氧还蛋白处理后，利用荧光巯基探针标记巯基，目标蛋白会带上荧光探针。再进行对角线电泳时，如果发现目标蛋白存在分子内二硫键，则经处理后所得的点位于对角线的上方；如果目标蛋白存在分子间二硫键，则经处理后得到的点位于对角线的下方。 3．蛋白质测序举例 insulin 21个氨基酸残基 30个氨基酸残基 4．指纹图谱（finger print）法 2．谷胱甘肽(glutathione,GSH) 谷胱甘肽参与细胞内的氧化还原反应，是某些酶的辅酶 γ β α 3．多肽抗菌素 为环状、含D型氨基酸 4．多肽激素 下丘脑的神经细胞中合成的多肽激素（九肽、环形） 5．神经肽 甲硫氨酸脑啡肽 Tyr–Gly–Gly–phe- Met 亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 功能：镇痛 如脑啡肽 (enkephalin) 脑啡与其受体结合后可以产生镇痛效果 麻啡可以模拟脑啡的作用，因此有类似的效用 （四）肽的人工合成 1．概况 20世纪初 E. Fischer：以氨基酸为原料合成了一个十八肽。 1932年 M.Bergman: Cbz 1953年 美国 Du.Vigneaud：生物活性的催产素 1965年 中国：生物活性的牛胰岛素 1962年 美国Merrifield：固相合成法 2．合成方法 （1）液相合成法 ① 用缩合剂的方法 氨基保护基Y：Cbz、Boc、Tos 羧基保护基Z：甲酯（OMe）CH3O- 乙酯（OEt）C2H5O- 苄酯（OBzl） 叔丁酯（OBut） 缩合剂：N，N′一二环己基碳二亚胺（N，N′-dicyclohexyl carbodiimide，缩写DCCI或DCC） 脱去氨基保护基的方法： Boc用酸，如50%三氟醋酸脱去 Tos用钠氨还原法 脱去羧基保护基的方法： 苄酯（OBzl）用催化加氢法 叔丁酯（OBut）用酸，如50%三氟醋酸脱去 Cbz用催化加氢法 甲酯或乙酯用皂化法 ② 将参与肽键合成的羧基和氨基活化 羧基的活化: 氨基的活化： 接肽时加入有机碱如三乙胺或KHCO3等，保证氨基处于自由状态，氨基即活化。 早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而现在用了最多的是活化酯法和混合酸酐法。 液相合成的优缺点： 每步都要纯化，产品纯度有保障，合成小肽合适。 每次和肽都要保护、活化，纯化，工作量大，费时费力 （2）固相合成法 反复使用酸脱帽，会使肽键断裂，不适于合成对酸不稳定的肽（含色氨酸） 可用碱脱Fmoc基。 固相合成的优缺点 简单、快速，不存在肽的溶解度问题 纯度不如液相法，适于合成十到三十肽 四、蛋白质的分类 （一）根据蛋白质分子的形状 1．球状蛋白质（globular protein） 似球，易溶解，如血红蛋白，血清球蛋白 2．纤维状蛋白质（fibrous protein） 似纤维，不溶于水，如角蛋白、丝蛋白 （二）根据组成和溶解度 1．单纯蛋白质（simple protein）: 也称简单蛋白质，完全由氨基酸组 成的蛋白质。 单纯蛋白质的分类（根据溶解度的不同） (1) 清蛋白（albumin）：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清 蛋白、乳清蛋白。 (2) 球蛋白（globulin）：不溶于水而溶于稀盐溶液，如血清球蛋白。 (3) 谷蛋白（glutelin）：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、 稀碱，如米谷蛋白。 (4) 谷醇溶蛋白（prolamine）：不溶于水，但溶于70%～80