2011AC_Anoptimizedmagnetitemicroparticle-basedphosphopeptideenrichment要点解析.docxVIP

在免疫沉淀蛋白中以确定多个磷酸化位点的一种基于磷酸肽富集优化的磁铁矿微粒策略 摘要 为了进一步提高选择性和实时细胞裂解液样品磷酸化肽分析产出，在这里我们证明了一个通过新合成的磁铁矿微粒高效富集磷酸肽的方法和质谱分析方法。磁铁矿微粒显示了良好的磁响应性和在溶液中磷酸肽富集再分散性。首先通过对包含已知的磷酸化和非磷酸化蛋白的混合物磁铁矿微粒富集磷酸肽的选择性和灵敏度进行评估。与商用的二氧化钛薄被磁性珠相比，我们的磁铁矿微粒对磷酸肽的富集具有更好的特异性。来自β-酪蛋白胰蛋白酶消化的选择性富集磷酸肽可以检测到0.4fmol/μl，而单磷酸肽的回收率约为90%。基于亲和技术并优化富集条件的磁铁矿微粒被 立即应用于识别信号蛋白所有的磷酸化位点，蛋白是从刺激哺乳动物细胞培养液中分离的。从磁铁矿颗粒富集步骤洗脱下来的大部分肽碎片通过串联质谱法作为单或多磷酸化种类被识别和表征。由于富集磷酸肽的实用高效，在磷酸化蛋白质组学研究实时细胞裂解液时磁铁微粒保持着巨大的潜力。 可逆磷酸化是最重要的一个遗传翻译修饰法（PTMs），它规定了细胞的处理工艺。据估计，在哺乳动物细胞中超过30%的蛋白质被暂时或永久磷酸化。在分子水平上对这些生物工序理解其机理要求具有磷酸化蛋白的特征。通过自上而下与自下而上的蛋白质组学方法质谱（MS）已被用作为识别和表征磷酸化蛋白质的精确工具。研究报告范围从大规模的高流通量的磷酸化蛋白识别精确定量磷酸化蛋白质组的特殊磷酸化的情况和磷酸化位点的定位。然而，由于受到有限样本量，低拷贝数，信号抑制，电离效率的影响，通过质谱分析磷蛋白仍然存在挑战，在MS分析化之前或分析时磷酸化碎片易损耗。例如，质谱中的磷酸肽正离子信号通过从其他非磷酸肽母体被抑制，该现象归因于低丰度和酸性天然的磷酸肽。通过富集磷酸肽提高质谱分析的离子信号的步骤通常是对来自复杂的蛋白水解混合物磷酸化肽识别的必要准备步骤。 各种丰富的策略已经被开发，包括免疫沉降法（IP），化学改性，和固定金属亲和层析色谱法（IMAC），而这些方法，IMAC是在线和离线液相色谱应用最广泛。在IMAC柱，金属离子（Fe3+，Ga3 +，Zr4 +等）通过能与磷酸化肽金属结合配体固定在琼脂糖树脂上。其他的各种亲和媒介已经开发，包括二氧化钛柱，氧化锆柱，铝氢氧化钠柱，与磷酸锆硅片。在IMAC柱由于非磷酸化肽的非特异性吸附磷酸化肽的选择性吸附而受限制，特别是含有多个肽酸性残基。此外，IMAC柱的制备是耗时的，且需要多步的，包括树脂负载，金属离子螯合，重复洗涤。 作为上述方法的另一种方法，功能化的纳米颗粒（NPs）可以作为一个水溶性探针快速具体地浓缩目标生物分子。不同于以往的柱状或平面支撑板，由于纳米颗粒的巨大的表面面积与体积比这些“悬浮分散法”提高分散的均匀性和效率和简易表面工艺。各种分子可以共价结合在NP-表面，以如磷酸肽目标生化分子反应形成稳定的共轭物。 为了达到卓越的分离能力，纳米颗粒表面工程可以进一步调整为一个具有磁芯（例如，磁铁矿，磁赤铁矿）的核心/壳结构加速亲和探针的收集。最近几次报道磁性表面纳米粒子探针为直接质谱检测有效的提取和富集磷酸化肽段，包括Fe3O4@TiO2（ZrO2，Al2O3）NPs，Fe3+固定介孔纳米二氧化硅，Fe3+固定化分子筛纳米晶体，Ce4+固定化磁性二氧化硅微球，磁性探头显示了一个很大的优势，对微量的目标磷酸肽成富集和在生物混合物溶液中快速分离。相比之下，非磁性探头分离需要长时间高速离心，往往导致其它肽的非特异性包裹，特别是大分子量的非磷酸化肽。除了固定金属离子之外，金属氧化物（TiO2，ZrO2，Al2O3等）已发展到从复杂样品中选择性地浓缩磷酸化肽。这些金属氧化物显示出更好的选择性，因为拥有磷酸基团的被分析物通过单，双和双齿桥联协调模式可以自动组装到金属氧化物表面。 然而，在以往的研究中，磁性氧化铁材料（磁铁矿和磁赤铁矿）作为磁核亲和探针。磷酸肽富集没有被重点使用磁性氧化铁材料[简要]。磷酸化肽段的富集没有把使用磁性氧化铁材料作为核心。赤裸的磁性氧化铁纳米颗粒富集磷酸肽以前已被证明。在这里，我们评估了使用亚微米级大小的磁铁矿微粒的可行性，作为对磷酸肽富集亲和探针在溶液中磁铁矿微粒具有高磁的响应性和再分散性。亚微米级的磁铁矿微粒采用一步水热法合成，与微粒相结合的超顺磁性活性和磷酸化肽富集，因此避免耗时的核心/壳结构工艺，其次是表面功能化。相对于TiO2/Fe3O4的核/壳纳米粒子（商业二氧化钛磁珠），新开发的磁性微粒对磷酸肽表现出更好的专一性/选择性。此外，我们证明了实用程序通过信号蛋白微粒富集磷酸肽，通过IP从脂多糖（LPS）刺激细胞分离富含亮氨酸重复Fli-1，反应蛋白2（LRRFIP2）。LRRFIP2是第