兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定要点.docVIP

兔肌肌酸激酶的分离纯化 及部分性质的测定 实验目的： 通过兔肌肌酸激酶的分离纯化及其酶活性质的测定，进一步熟悉和综合运用各种分离提纯办法，熟练掌握生化实验的基本方法。 进一步掌握酶的分离纯化方法，了解兔肌肌酸激酶的部分酶性质。 实验内容及实验技术： 实验内容： 肌酸激酶概况； 肌酸激酶的催化机制； 肌酸激酶的测活方法—pH比色法； 肌酸激酶的分离纯化； 肌酸激酶的动力学参数测定； 肌酸激酶DTNB修饰反应动力学及酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定。 实验技术： 颈动脉放血杀兔子； 机械法粉碎动物材料的方法； 盐析、等电点沉淀和有机溶剂变性、热变性除杂蛋白； 盐浴与冰盐浴盐析目的蛋白肌酸激酶(CK)； 乙醇分级除杂蛋白和沉淀目的蛋白肌酸激酶； -8℃，12000r/m高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白； 透析法除残余有机溶剂小分子； 凸形梯度洗脱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白CK； pH比色法测定酶活性； A280光吸收法测定酶浓度； 酶的动力学参数（Ka,Vmax）的测定； CK的DTNB修饰反应动力学； 酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定； SDS测定亚基的分子质量和CK纯度； 凝胶层析测定CK分子质量。 实验原理： 肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应： 肌酸激酶有四种同工酶形式：即肌肉型（ＭＭ）、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，而MiMi型存在于线粒体内膜上。前3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶。 细胞在线粒体上发生氧化磷酸化，产生ATP。但动物体内贮存能量的高能物质不是ATP而是磷酸肌酸。能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制(creatine phosphaate shuttle)来完成的，这个机制包含了肌酸激酶的线粒体型和肌肉型两种同工酶。氧化磷酸化产生的ATP在ATP-ADP转位酶(translocase)的帮助下被直接送到位于线粒体内膜外侧的线粒体型肌酸激酶所在部位（Ⅰ），线粒体型肌酸激酶将ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上，变成ADP和高能物质磷酸肌酸（Ⅱ）。磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维(myofibrils)，肌原纤维的M-区带上结合了肌肉型肌酸激酶（Ⅲ），这样，当肌肉收缩时，需要大量的ATP供给能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为ATP，而反应产生的肌酸再扩散回线粒体，重新磷酸化（Ⅳ）。 肌酸激酶同工酶具有重要的生理功能和医学应用价值。 肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。在催化过程中，该酶的最小功能单位是亚基，亚基在二聚体中独立地起催化作用。根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子质量为43 000u左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有25 %-30 ％的α-螺旋，15 ％左右的β-折叠。 肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的Kuby 法。 该酶的测活方法也有许多种，本实验采用的是pH-比色法。 肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）： 肌酸激酶在催化正向反应时，随着ATP向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的H+，其最适pH为7.5-9.0，在此范围内测定H+ 的生成速度，可以作为酶活力的指标。本实验采用百里酚蓝作为pH指示剂，在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的活性，即在597nm波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化反应生成的H+使溶液的pH值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光度值A597不断降低。 在pH-比色法中，肌酸激酶测活的底物溶液需要新配。配制方法见试剂部分。 测活时，取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中，加入10(l 酶溶液，迅速盖盖，混匀后立即监测597nm处光吸收的变化，每15秒或30秒(A597 )，共读取8个数据点，用A597对时间作图，从图中求出每min吸光度值的变化，即△A597。并按下式计算酶的比活力（U）： （μmol／(min(g)） 其中：1.3 为吸光度的变化换算成H+的系数。 VA =1.0ml (底物溶液)， VB =0.01ml (加入的酶溶液)。 C：加入酶溶液的浓度。 酶溶液浓度C的测定按其在280nm 处的吸光度值来确定，其百分吸光系数为 E1％1cm=8.8。 即： 试剂： KCl：0.01mol/L，200ml。 (0.15g KCl 加水至200ml) NH4OH：1.7mmol/L，1000ml。(取0.