牛血清白蛋白与核黄素荧光共振能量 毕业论文.doc

牛血清白蛋白与核黄素荧光共振能量 摘要：本文采用荧光光谱法尝试在弱碱性溶液中以为给体为受体μL pH 7.43的Tris-HCl 缓冲液中，反应时间为8min，6.9×10-7mol/L CTMAB，核黄素的浓度为1.2×10-6～×10-5mol/L范围时，其线性回归方程Fa/Fd =0.0863+0.0884C (10-6 mol/L)，相关指数和检测限分别为0.9973和2.6×10-8mol/L。该方法灵敏度高，为核黄素的测定提供了新的方法。 关键词荧光荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)是一种非辐射能量跃迁通过分子间的电偶极相互作用将给体激发态能量转移到受体激发态的过程FRET需要几个条件：供受体在空间上比较接近(1～10nm)；供体的荧光量子产率较高；供体的发射光谱与受体的吸收光谱要重叠;供、受体的发射光谱要足够分开[5, 6]。目前荧光共振能量转移技术已应用于无机离子的测定,8]，维生素的测定[9,10]，蛋白质分析以及作为核酸荧光探针的研究等诸多领域以为给体为受体 实验部分 .1 仪器和试剂 F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司配有R3896型红敏光电倍增管10mm标准石英池）；PHS-3CT型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）；mol/L 的BSA 标准溶液，6.0×10-4mol/L核黄素标准溶液，两种标准溶液均在0～4℃冰箱中保存。实验所需浓度由此稀释而得。Tris，HCl，NaCl均为分析纯；水为双重蒸馏水。 1.2 实验方法μL pH=7.43的Tris-HCl缓冲溶液，60μL浓度为1.15×10-4 mol/L CTMAB溶液，100μL 浓度为1.0×10-4mol/L BSA，一定浓度的核黄素溶液，定容到10mL，放置8min，在荧光分光光度计上，以295nm为激发波长，测定Fa 和Fd，计算Fa/Fd，做标准工作曲线。 2 结果与讨论 2.1 FRET的构建 BSA与核黄素的荧光能量转移的首要条件就是给体的发射光谱和受体的吸收光谱要有相当程度的重叠[12]。在实验条件下，BSA的荧光峰 ( 350 nm)与VB2的吸收峰 ( 375nm)有较好的重叠。这样就为BSA和VB2的能量转移提供了前提条件。用波长为295nm去激发BSA和VB2的混合体系，既可以保证BSA有较大的发射，而VB2又不会被激发，使能量转移效果好。实验中观察到，在混合体系中，给体在295nm处的荧光峰比单独存在时明显下降，而VB2的荧光峰比单独存在时明显增强，这充分说明了在这两种物质间确实发生了荧光能量转移 (图1)。加入NaCl溶液时对于体系，BSA荧光强度减小不明显，VB2 的荧光强度增大不明显，说明离子强度对体系影响不明显；加入CTMAB时BSA荧光强度减小明显，VB2 的荧光强度增大明显，且荧光峰位均没有变化，也就是说CTMAB对体系荧光共振能量转移的影响明显。 图 1　BSA-VB2荧光共振能量转移光谱图 1: BSA, 2: VB2, 3: BSA+VB2, 4: BSA+VB2+NaCl, 5: BSA+VB2+CTMAB 2.2 影响FRET的主要因素 2.2.1 考察酸度对体系的影响. 在激发波长为295 nm条件下，测定了不同pH的缓冲溶液对荧光强度的影响。由实验结果发现，在BSA和VB2的浓度分别为2.0×10-6mol/L和1.2×10-5mol/L的条件下，pH 值为7.43，用量为80μL时Fa/Fd最大，所以本实验选用Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.43，用量为80μL，见图2和图3。 图2 PH值的影响 图3 缓冲溶液浓度的影响 2.2.2 考察CTMAB浓度对FRET体系的影响 在激发波长为295nm条件下，测定了不同浓度的CTMAB对荧光强度的影响，实验结果发现用6.9×10-7mol/L的CTMAB时Fa/Fd最大，所以本实验的最佳CTMAB的浓度为6.9 ×10-7mol/L，见图4。 图4 CTMAB浓度的影响 BSA: 2.0×10-6 mol/L; VB2: 1.2×10-5mol /L; Tris-HCl: 80μL pH =7.43 2.2.3 考察时间对FRET体系的影响 以激发波长为295 nm的波长激发，BSA和 VB2的浓度分别为2.0×10-6mol/L和1.2×10-5mol/L的条件下，测定不同时间对体系的影响，经实验发现在实验反应8min 时Fa/Fd最大（图5），所以本实验选用的反应时间为8min。 图5 反应时间对FRET的影响 　BSA: 2.0×10-6 mol/L; VB2: 1.2×10-5mol/L; CT