化学研究标记版教程分析.doc

化学研究报告 标记活细胞内蛋白质的化学标签CHAORAN JING AND VIRGINIA W. CORNISH* 哥伦比亚大学化学系，美国纽约州10027，纽约，西第120街550，三菱商事4854，NWC大厦收2011年3月31日 基于一个世纪在理解蛋白质试管中工作方式的极大进展，我们现在面理解大分子机器信号通路和其他生物网络活细胞的复杂环境如何挑战。虽然FPs继续是用于细胞生物学的工具，他们在面蛋白质愈益动态度量上个世纪体外生物物理学蛋白附着到一个多肽，而不是一个。FlAsH肽标签于1998年首次发布。自那时以来，更精致的蛋白质标签，例如TMP和SNAP标签，提高了选择性，并使细胞内蛋白质以高信噪比成像。进一步改进仍然需要实现强大的荧光基团直接掺入，但酶介导的化学标签很难选择性标记短肽标签。 在这个方面，我们专注于化学标记在研究活细胞内蛋白质工作方式的开发和应用。因此，对于不同的化学标记策略和技术，我们重视标记反应足够的选择性和荧光探针对细胞内蛋白质高信噪比成像。我们重视最近FP在相当困难甚至是不可能的复杂的生物化学标记测量方面的应用。最后，我们得出期待的结论（i）与活细胞兼容的高光子输出的化学标记的发展使高分辨率成像，（ii）化学标签有潜力显著降低标签大小（iii）除荧光成像之外的模块化标签的开发。 ————————————————————————— 简介 在上个世纪，用有机荧光和其他生物物理探针进行位点特异性标记蛋白的化学方法显著影响体外蛋白质的基础研究。尽管事实上，显微注射技术在技术上需要损害细胞，但是这些化学探针实际应用中显示，显微注射进细胞的纯化蛋白质的化学修饰，仍然应用于活细胞成像。体外化学探针可以被设计的对胱氨酸和赖氨酸残基选择性地发生反应,因此在体外，标记纯化的蛋白质很有效，然而，细胞中存在的大量的蛋白质和其它能够反应的一系列物质根本就没有所需要的能够被选择性标记的特定的蛋白质。 图1.在活细胞中选择性标记蛋白质的不同策略的代表性实例技术示意图。（A）短肽的中心是四半胱氨酸，两端分别与含砷的荧光团相连，荧光标记使短肽更突出。（B）eDHFR/TMP标记策略是基于蛋白质eDHFR的TMP-二聚体探针的非共价，高亲和力的结合。（C）在SNAP-标记，酶hAGT利用鸟嘌呤探头异质二聚体作为自杀底物。（D）生物素连接酶用生物素类似物来修饰短肽标签，然后生物素类似物在第二步与探针反应。 1994年，活细胞成像随有选择性的遗传的蛋白标签荧光蛋白（fps）突破。绿色荧光（GFP）A.victoria，是一种238个氨基酸的蛋白质，11-链β-的心酪氨酸和甘氨酸残基折叠后自发形成荧光标记用于观察蛋白质在活细胞中的时和位置的表达，经常提供显著洞察力30kD的蛋白质，荧光蛋白可以破坏集合、互动或标记蛋白的功能;荧光蛋白通常具有广阔的吸收和发射光谱，使其在技术上要求监测甚至只是三种不同的蛋白质同时使用多色成像；荧光蛋白能遭受低聚和/或缓慢的折叠和发色团的成熟;荧光团的专业性能难以操纵，因为它是荧光蛋白固有的序列;更重要的是，在光子输出方面（经常测量亮度和耐光性），关键是单分子分辨率，在这一点上，没有一种荧光蛋白可以跟最合适的有机荧光团、更少的纳米颗粒或其他新兴的化学探针媲美。因此，化学标签为已开发的标记蛋白质提供了另一种可以替代的直接在活细胞中得到的化学探针。 用化学标签标记蛋白 用化学标签标记靶蛋白，而不是用荧光蛋白标记，这种靶蛋白用多肽标记，也就是随后经过改良的有机荧光团。技nically，用化学标签标记靶蛋白与用荧光蛋白标记靶蛋白是非常类似的：目标蛋白质和多肽的标签间质粒编码的融合是使用标准的分子克隆技术建构并导入到所希望的细胞中的。有机荧光团扩散到细胞中，然后通过特异性结合或与多肽标记相偶联，并培养细胞。因此，化学标签仍然保留用荧光蛋白实现蛋白质标记的特点，但是通过基因编码，但提供更小更可靠的标签以及有较高的光子输出和定制功能有机荧光团的模块化的使用。 第一份关于在活细胞中用有机荧光团标记蛋白质的荧光蛋白的替代品的报告钱学森和他的同事在1998年发表的《FLASH》。报告中指出，Flash是理想的化学标签，短短15个氨基酸的多肽标签，中心是两端分别与含砷的荧光素配合的四半胱氨酸（CCXXCC），荧光性增强基于结合了多肽标签（图1A）。迄今为止，一些l两端含砷的荧光团和相对应的四半胱氨酸（TC）的标签的已发布，其中最初的绿色荧光FlAsH和红色荧光ReAsH应用的最频繁。尽管其优雅的设计，技术实际上遭受细胞中含有丰富硫醇的生物分子的非特异性标记、两端含砷配体的毒性和标记的条件。然而，受惠于它的体积小，往往是唯一可行的标记被250个氨基酸荧光蛋白损害的蛋白质或复合物的标签。（通过250个氨基酸荧光蛋白标记被损害的蛋白质