一、二、三、四代测序技术原理详解.pdfVIP

⼀⼀、、⼆⼆、、三三、、四四代代测测序序技技术术原原理理详详解解 测序技术是基因组学的核⼼技术，上期的推送 【LAI 基因组组装质量评估新标准】简单介绍了测序技术的发展进程。其实，测序技术的发展主要 基于两个⾮常具有⾥程碑意义的理念 ““⽣⽣命命是是序序列列的的””和和 ““⽣⽣命命是是数数据据的的””。。序序列列是是基基因因组组学学最最基基本本最最重重要要的的数数据据，，也也是是⽣⽣命命科科学学领领域域 ⼤⼤数数据据时时代代的的核核⼼⼼组组成成部部分分。。简简单单来来说说，，测测序序技技术术就就是是将将DDNNAA// RRNNAA分分⼦⼦中中碱碱基基AATTGGCC的的排排列列顺顺序序显显⽰⽰出出来来。。 年，，WWaattssoonn和和CCrriicckk提提出出DDNNAA双双螺螺旋旋结结构构。。 DNA双螺旋模型以及 “⽣命是序列的”观点的发表，直接推动了测序技术的发展，因为解读⽣命遗传信息的前提就是得到它的载体——序列。 从20世纪70年代到现在有很多测序技术和平台的产⽣，其中包括SBC法、454、Ion Torrent、SBL法、Sanger法、Illumina、Pacbio、 Nanopore等。今天主要跟⼤家分享后四种常⽤的测序技术。 第第⼀⼀代代测测序序技技术术 Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术，⼜称为SBS法、末端终⽌法。1975年由Sanger提出，并于1977发表第⼀个完整的⽣物体基因组序 列。 核核⼼⼼原原理理 由由于于双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸((ddddNNTTPP))的的33’’位位置置脱脱氧氧，，其其在在DDNNAA 的的合合成成过过程程 中中不不能能形形成成磷磷酸酸⼆⼆酯酯键键 ，，因因此此可可以以⽤⽤来来中中断断DDNNAA合合成成反反 应应 ，，在在44个个DDNNAA合合成成反反应应体体系系中中分分别别加加⼊⼊⼀⼀定定⽐⽐例例带带有有放放射射性性同同位位素素标标记记的的ddddNNTTPP （（分分为为 ddddAATTPP,,ddddCCTTPP,,ddddGGTTPP和和ddddTTTTPP）） ，，通通 过过凝凝胶胶 电电泳泳和和放放射射 ⾃⾃显显影影 ，，根根据据 电电泳泳带带的的位位置置确确定定待待测测分分⼦⼦的的DDNNAA序序列列。。 在每个反应体系中，ddNTP相对于dNTP是很少的，所以只有部分新链在不同的位置特异性终⽌，最终就会得到⼀系列长度不⼀的序列。 第第⼆⼆代代测测序序技技术术 以Illumina平台为代表的第⼆代测序技术实现了⾼通量测序，有了⾰命性进展，使得⼤规模并⾏测序成为现实，极⼤推动了⽣命科学领域基因组学 的发展。Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终⽌)的核⼼技术是DNA合成的可逆性末端循 环，即3-OH可逆性的修饰和去修饰。 基基本本原原理理 将将ddNNTTPP的的33--OOHH以以叠叠氮氮集集团团RRTTGG ((RReevveerrssiibbllee TTeerrmmiinnaatt iinngg GGrroouupp,,可可逆逆末末端端基基团团))进进⾏⾏修修饰饰 ；；将将44种种碱碱基基分分别别与与不不同同的的荧荧 光光分分⼦⼦连连接接 ；；DDNNAA合合成成时时，，RRTTGG能能起起到到类类似似于于ddddNNTTPP的的作作⽤⽤终终⽌⽌反反应应 ；；每每次次合合成成反反应应终终⽌⽌并并读读取取信信号号之之后后 ，，洗洗脱脱RRTTGG和和荧荧光光分分⼦⼦，，进进 ⾏⾏下下⼀⼀轮轮循循环环。。 主主要要过过程程 a, DNA待测⽂库构建 利⽤超声波把待测的DNA样本打断成⼩⽚段，并在这些⼩⽚段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA⽂库。这些⽂库中的DNA在通过 flowcell(吸附流动DNA⽚段的槽道)时会随机附着在flowcell表⾯的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表⾯都附有很多接 头，这些接头能和建库过程中加在DNA⽚段两端的接头相互配对，并能⽀持DNA在其表⾯进⾏桥式PCR的扩增。 b,c 桥桥式式PPCCRR以以FFlloowwcceellll表表⾯⾯所所固固定定的的接接头头为为模模板板，，进进⾏⾏桥桥形形扩扩增增。。经经过过不不断断的的扩扩增增和和变变性性循循环环 ，，最最终终每每个个DDNNAA⽚⽚段段都都将将在在各各 ⾃⾃的的位位置置 上上集