Apoptosis概要.ppt

2、Hoechst 33258染色法（双苯丙咪唑）活细胞：核呈弥散均匀荧光。凋亡细胞：核或胞质见浓染致密颗粒状荧光 1.琼脂糖凝胶电泳 （agarose gel electrophoresis） 凋亡细胞：电泳谱呈典型的“梯状带” （ladder pattern） 坏死细胞或凋亡后期继发性坏死细胞： DNA电泳后则成模糊 smear pattern 2.脉冲场凝胶电泳（PFGE） 非典型细胞凋亡细胞形成50-300kb的HMW DNA片段，出现比LMW片段出现要早，是凋亡细胞核DNA核酸内切酶的底物,进一 步降解形成梯形带 原理:采用抗组蛋白抗体和抗DNA抗体夹心法进行测定，抗组蛋白抗体包被测定板，加入含有核小体和寡聚核小体的凋亡细胞裂解物，与抗组蛋白抗本结合。最后，加入过氧化物酶（POD）标记的抗DNA抗体，此抗体可与已固定在酶标板上的核小体或寡聚核小体中的DNA结合，通过酶标测定仪分析，即 可定量测定凋亡细胞 1.拒染试验:台盼蓝、PI、EB等为膜不通透性染料， 死细胞核着色、活细胞及凋亡细胞不着色 2.浓染试验：Hoechst 33342和33258等为膜通透性 染料，使凋亡细胞着色浓密 3.双重染色：对正常和凋亡细胞跨膜通透性不同,与 凋亡细胞DNA染料结合能力不同有关的两种DNA 染料同时染细胞，常用AO和EB双重染色 正常细胞:AO将其染为强绿色，EB染色较弱 凋亡细胞:AO染色仍为阳性，EB红染轻度增加，坏死 细胞，EB红染色明显增强，AO染色却变暗 1.免疫组化染色检测 2.蛋白印迹法 3.流式细胞分析 1.细胞表面糖蛋白的终末唾液酸残基的丢失 而使新糖残基暴露 2.新的细胞膜表面糖蛋白的出现 3.细胞膜的磷脂不对称性的丧失，改变细胞 膜表面的疏水性(hydrophobicity)和电荷 4.目前较肯定的方法:检测细胞膜磷脂分布 改变(Annexin V) Caspases在细胞凋亡发生过程中起十分关键作 用，分析caspases的活性可较许多其他方 法更能检测细胞凋亡的早期事件 蛋白印迹法:检测凋亡细胞内caspases裂解产物 以抗PARP的抗体可分析完整和裂解的PARP 酶免疫吸附法:检测caspase 3活性 组织或细胞 细胞群 单个细胞 Caspase 3 DNA片段 PARP抗体 DNA梯形带 TUNEL ISNT Annexin-V 细胞凋亡检测 IENA ELISA 蛋白印迹 琼脂糖电泳 FCM 荧光显微镜 光学显微镜 1.DNA片段化可作为研究群体细胞中单个细胞凋 　亡状态，用外源性TdT标记细胞内DNA断裂末 　段；或插入染色质DNA的荧光染料，当DNA结　 　合染料后可显很强的荧光 2.检测凋亡细胞膜变化:Annexin V，拒染试验 分析单个细胞凋亡 主要依据：DNA特征性降解和酶学变化 观察细胞形态最好方法 凋亡细胞:染色质固缩，聚集于核膜、块状,新 月型，细胞器完整 ,凋亡小体形成 坏死细胞：核固缩，但染色质分布无规律， 边界不清，细胞器常有结构破坏， 细胞膜破裂 凋亡小体 （三） 扫描电子显微镜观察法 结果判断： 微绒毛消失 细胞膜发泡 （四）荧光显微镜观察法 1、吖啶橙染色法（AO）:膜通透性 结果判断：DNA为黄色或黄绿色均匀荧光， RNA为桔黄或桔红色荧光 正常细胞(核染色质结构正常，胞膜完整，着均匀的绿色)； 早期凋亡细胞(核染亮绿色呈致密斑块或碎片状)； 晚期凋亡细胞(核染橘红色呈致密斑块或碎片状); 坏死细胞(胞膜破损、核膜完整，染色质染均匀的红色)。 流式细胞仪（flow cytometry, FCM） 通过荧光激发分选细胞，大量快速地测定单个细胞。目前应用较多的一类方法，尤其适用于成单一分布的细胞，如淋巴细胞、血细胞、骨髓细胞、培养细胞等。 优点： 1.快速、高灵敏度地进行多参数测定, 可分散为单一细胞群体细胞中每个 细胞的生物学变化 2.检测的重复性好，结果准确，测定 细胞数量多（104～105） 3.对活体细胞进行分析 4.定量检测凋亡细胞数和凋亡指数,测定 凋亡细胞发生于某个特定细胞周期 5.测定细胞增殖率与死亡率,了解肿 瘤生长/死亡速率，测知药物疗效 6.测定凋亡细胞膜早期改变及与凋亡 相关的各种基因蛋白表达 7.利用FCM的荧光激活细