Chapter Five Separating Target Gene.ppt

2.序列克隆法 根据目的基因的核苷酸序列分离目的基因。 ■根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因 其基本原理是：先从DNA序列数据库（如GenBank）中查找目的基因的部分序列或其同源基因的序列，再用目的基因或其同源基因的部分序列合成核酸探针。用核酸探针与基因组文库或cDNA文库进行杂交，从而获取含目的基因的克隆子。 ■表达序列标签法分离目的基因 适用于从cDNA文库中一次性大量分离各种已知及未知基因。 其基本步骤如下： a：从组织特异性或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆，进行5’端和3’端部分序列（约400bp）的测定。 b：通过对DNA序列数据库（如GenBank）进行联机检索，可以检测出许多已知基因和许多未知基因。 c：通过对基因文库的筛选或基因定位的方法分离目的基因。 ■基因表达系列分析法 此方法可以用来分离在不同发育阶段和生理状态下差别表达的基因。其优点在于可以一次性对大量基因的转录产物进行定量分析，从中找出新的基因。 3.差别杂交及减法杂交技术 ■差别杂交法 差别杂交法适用于分离在特定组织中或特定发育阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，也可有效地来分离经特殊处理诱导表达的基因。 原理： a：制备两种不同的细胞群体，在一个细胞群中目的基因能够表达，而在另一个细胞群体中目的基因不能够表达。 b：分别制备两种不同细胞群体的mRNA，其中一个群体含有一定比例的目的基因mRNA，另一个群体不含有目的基因mRNA。 c：以两种总mRNA（或它们的cDNA拷贝）为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目 的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余菌落都呈阳性反应。 d：通过对比，即可挑选出含目的基因的菌落。 举例：分离血清诱导表达的生长因子调节基因 ■减法杂交技术 该技术是通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。 减法杂交的对象可以是基因组DNA，也可以是cDNA，相应的称为基因组DNA减法杂交和mRNA减法杂交。 mRNA减法杂交 原理：利用羟磷灰石柱只结合单链DNA，不结合双链DNA。从表达该蛋白和不表达该蛋白的组织细胞中分别提取和分离 mRNA。特异表达该蛋白的组织的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达组织的mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行克隆。 举例：T细胞受体编码基因的分离 基因组DNA减法杂交 主要用来分离缺失突变基因。 4.利用差示分析法分离目的基因 ■mRNA差别显示技术 该方法主要用于分离不同（处理）组织或细胞中差别表达的mRNA。 其基本原理如下： a：真核生物中绝大多数mRNA均带有poly（A）尾巴结构，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA为模板，以oligo（dT）为引物合成出cDNA拷贝。在poly（A）上游的两个碱基只有12种可能的排列组合，因此可总共合成12种不同的3’端引物（ oligo（dT） 11MN或oligo（dT）12 MN ）。 b：设计20种由10个核苷酸组成的5’端随机引物。 c：12种不同的3’端引物和10种5’端随机引物组成240组引物对做PCR扩增，应能得到20000条左右的DNA条带，其中每一 条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体涵盖了在一定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部mRNA种类。 d：在PCR反应中加入放射性物质标记反应产物。PCR反应完成后，对产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影可发现一对引物在凝胶板上可显示60~160个条带，条带大小在100~150bp范围。在同一胶板上进行不同样品的对比，就可显示出差异表达的条带。 e：将差异条带从胶上切割下来，回收cDNA，利用该片段制备探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选，以分离差别显示的基因。 ■代表性差别分析技术 ■抑止性减法杂交技术 ■基因组错配筛选 5.功能结合法筛选目的基因 该方法是针对cDNA表达文库来分离目的cDNA克隆子。 原理：根据目的基因表达产物的某种结合功能完成目的基因的分离筛选。 ■根据受体/配体结合、酶和底物结合分离目的基因 在钙离子存在时，钙调蛋白能与多个酶形成稳定的复合物。利用这一生物学特征，用放射性标记的钙调蛋白作为探针，筛选表达产物能与钙调蛋白结合的cDNA克隆子，结果在大脑组织中找到一个新的Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶亚单位。 ■根据基因表达调控蛋白能与特异的DNA片断结合分离编码基因表达调控蛋白的基因 用一段已