2、细菌分离培养、接种技术及生化分析报告.pptVIP

第三章 临床细菌学检验技术第二节 细菌分离培养与鉴定 P35 细菌在适宜的条件下方可生长繁殖，临床细菌标本只有经过细菌的分离培养鉴定和药敏试验，才能对感染性疾病作出病原学诊断和指导临床用药。故细菌的分离培养对疾病的预防与诊治有重要作用。 一、培养基的种类和选择(一)基本条件 1.合格的细菌实验室 2.合格的无菌实验室 3.基本设备和器具 (二)培养基 培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。 用途： ①可用于细菌的分离纯化、传代和菌种保存 ②可用于研究细菌的生理生化特性 ③是对病原菌分离鉴定的主要环节和必不可少的手段 1.培养基的组成成分： ⑴营养物质：水、蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、无机盐、鸡蛋和动物血清、生长因子（Vit、aa、嘌呤、嘧啶等）。 ⑵凝固物质： 最常用的为琼脂(agar)，它是从石花菜中提出来的一种半乳糖胶，100℃溶解，40℃凝固，可利用琼脂来改变培养基的物理性状(固体或半固体)，它是理想的固体培养基的赋形剂，其本身不被细菌分解利用，也无营养作用。 ⑶抑菌剂和指示剂： 不是细菌生长繁殖的必需物质，是制备细菌的选择、鉴别培养基和判断结果的需要。 常用的抑菌剂有：胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。 常用的指示剂有：酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国兰等酸碱指示剂，美兰为常用的氧化还原指示剂。 2.培养基的分类 液体培养基：牛肉汤 (牛肉浸液+1%蛋白胨 +0.5%NaCl pH7.4) 半固体培养基：加0.2~0.5% agar 固体培养基： 营养物+ 2% agar 基础培养基：是其他培养基的基础，如普通肉汤、 普通琼脂平板、斜面、高层 营养培养基：BAP、罗-琴培养基、吕氏血清斜面 选择培养基：SS平板、BS平板、Mac平板等 鉴别培养基：糖发酵管、MIU、KIA、TSI等 特殊培养基：厌氧培养基、高渗培养基等 3.常用培养基的制备 ⑴肉膏汤的制备： 0.3%牛肉浸膏 + 1%蛋白胨 + 0.5%NaCl加热溶解，调pH 7.4~7.6，分装，121℃，20分钟高压灭菌冷后待用。可用于标本和细菌的增菌。 ⑵普通琼脂平板、斜面、高层： 肉膏汤 + 2%agar，加热溶解， 121℃，20分钟高压灭菌冷至50℃ 平皿→ 普通琼脂平板：分离纯培养和药敏 倾倒 试管(斜放)→普通琼脂斜面：增菌、保存细菌 试管(直立)→普通琼脂高层：备用 ⑶血琼脂平板： 普通琼脂平板营养物质灭菌冷至50℃ + 5%~10%脱纤维SRbc或RRbc，摇匀，倾倒无菌平皿，冷凝后即成血平板。 常用于营养要求较高的细菌的分离纯培养和药敏。 ⑷半固体肉汤： 牛肉汤(牛肉浸膏汤)+ 0.2%~0.5%agar→加热溶化 →分装→高压灭菌→冷却即成。 常用于保存菌种和观察细菌的动力。 4. 选择适当的培养基： 根据临床标本中细菌的需要，选择适当的培养基。 二、分离培养 （一）细菌的分离 1. 平板划线分离法——分离纯培养 ①分区划线 ②连续划线 2. 斜面接种法 连续蜿蜒划线，从斜面底部至斜面顶端 3. 液体接种法 在试管内壁与液面交接处管壁上研磨，使细菌混于液体中。 4. 半固体接种法 穿刺接种法 倾注平板法 取一定量的稀释标本加入无菌平皿，再加入冷至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝后倒置培养。 6. 涂布法 把稀释定量被检菌液均匀涂布于琼脂平板表面。 7. 定量接种环法 　 把定量接种环沾取菌液均匀涂布于琼脂平板表面。 (二) 细菌的培养方法 根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养，常用培养方法有： 1. 需氧培养： 适用于需氧菌和兼性厌氧菌，在有氧环境下35℃孵育18~24h。 2. CO2培养：