新型核酸分子荧光探针-分子信标的研究进展论文.docVIP

新型核酸分子荧光探针-分子信标的研究进展 山东农业大学 化学与材料科学学院 宋伟杰 摘要 分子信标是一种设计巧妙的新型荧光标记核酸探针。它的最初设计是用来检测核酸，但是由于分子信标是特殊的发夹结构构成的，因此具有很强的特异性识别靶标序列的能力。分子信标对靶分子的检测具有高灵敏度、强选择性和实时监测等多种优点。因此，它在多重SNP测定和细胞内病毒表达等核酸检测及其多种DNA-蛋白质，DNA-DNA损伤等生物化学分析、生物医学研究及环境监测等各大领域发挥着重大作用。 引言 1996年Tyagi和Kramer等人设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针。分子信标是由特殊的发夹结构构成的，因此具有很强的特异性识别靶标序列的能力[1]]。分子信标的优点很多，如高灵敏性，强选择性及特别适用于活体实时监测功能。因此，其能够得到飞速发展。分子信标在生物化学分析、生物医药学研究等各大领域得到了广泛应用。并且随着科学技术的发展，新型分子信标也将得到不断的发展与进步，分子信标的应用领域也会不断拓展。 1 分子信标的结构及作用原理 1.1 分子信标的结构 分子信标是通过荧光标记而形成的。分子信标一般分为两种:一种是包含了环-茎两部分结构的单链寡核苷酸组成的，它的形状类似发夹型。另一种是无茎的，不含有双链结构的茎杆区，只含有单链的环状结构。环-茎型寡聚核苷酸序列的环上的寡聚核苷酸序列是分子信标的基因识别部分，一般含有15-30碱基序列。作为环状部分能够与靶基因自发进行杂交。茎区一般长度为5-12碱基互补序列，茎区是一个发夹结构，茎区两端分别连接有荧光基团和猝灭基团。一般来说，荧光基团和猝灭基团都是一些有机基团。在分子信标的5'端和3'端通过连接臂连接上了荧光基团和猝灭基团。无茎分子信标具有良好的柔韧性并且其结构如同一个闭环结构，当分子信标与靶序列特异性结合之后，探针与靶标形成的双链具有刚性结构从而使得荧光分子和猝灭分子分开，荧光恢复。 1.2 分子信标的作用原理 在自由状态下，分子信标未与靶分子进行特异性结合，由于茎杆区互补序列的结合使得探针分子形成发夹结构从而成为发夹探针。在自由状态下，由于茎部分两列互补碱基对之间的氢键连接，使得荧光基团和猝灭基团距离很近，荧光基团将能量转移给猝灭基团而发生荧光猝灭。有很多研究发现纳米金的猝灭效率更高，几乎能接近 100%[2,3,4]当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成的链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子之间的距离逐渐增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者之间距离的6次方成正比[5]。杂交之后，分子信标的荧光几乎完全恢复。并且荧光强度与溶液中靶标序列的量成正比，所以可以用来作定量分析。当然，在高温、高pH、DNA损伤等条件下会使分子信标的荧光信号增强，这也就决定分子信标的多用途性。无茎分子信标不含有与靶标无关的序列，设计和合成上相当简单，成本降低。由于二甲氨基偶氮苯甲酰（DABSYL）和黑洞猝灭剂（BHQ-2）对多种发射光谱不同的荧光基团都有很好的淬灭作用，在量子点分子信标中，也经常使用这两种猝灭基团[6,7]。无茎分子信标还具有响应快、特异性强等特点。但是由于其结构上少了茎区，稳定性有所下降，背景荧光相互增强。研究者们研究了很多方法来提高其信噪比。如设计 in-stem 分子信标[8]、引入多个荧光猝灭基团[9]或利用共轭聚合物作为发光基团[10]以及采用受激准分子发射[11,12]、电化学发光[13]等方法。 2 分子信标的应用 2.1用于核酸检测分析 2.1.1实时定量PCR测定靶标的浓度 在PCR反应体系中加入扩增靶标序列互补的分子信标，然后用荧光ABI PRISM 7000型PCR监督，测定其扩增循环-荧光曲线。这样对于那些多余的分子信标无需分离。并且还能够实时定量的测定其扩增靶标的量。分子信标作为实时荧光探针是非常适合的。目前，分子信标已经成功的应用于各种病原体核酸的检测。作为一种新型的检测手段，其具有很多常规方法所不具有的优点。测定时具有很高的灵敏度和特异性。操作简单易行、可避免污染。能够实时的检测[14-16]。随着科学技术的发展，把分子信标探针与PCR技术相结合来监测的报告越来越多。例如，对果汁和牛奶中大肠杆菌0157、H7的检测[17]；对沙门氏杆菌的半自动快速检测；对人体肺癌细胞中骨形成的蛋白质受体mRNA的识别检测；对细菌人工染色体克隆的检定；对HIV-1的定量分析；Y染色体的精确测定等。 2.1.2 活体细胞中的RNA的测定 能够实时的对细胞体内的mRNA表达进行有效的检测将在疾病诊断、药物研发及分子生物学等各个方面发挥重大作用。然而在生物学以及近年来的反义核酸研究中，对活细胞内的m