李春强PEG原生质体制备.docVIP

尖孢镰刀菌PEG材料与方法 质粒pCT74，真菌Pyrenophora triticirepentis的ToxA启动子潮霉素B磷酸转移酶基因hygr）。 培养基LB培养基：酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl g、琼脂15 g、水1000 mL、pH 7.0 ；PDB培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g，水1000 mL；PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉l5 g、水1000 mL；再生半固体培养基：马铃薯200 g、山梨醇182 g、琼脂9 g、水1000 mL。 酶制剂崩溃酶 (Drislase，购自Sigma公司)，溶壁酶 (Lysing Enzyme，购自广东微生物所)。裂解液 稳渗剂0.8 mol·L-1 NaC1，山梨醇溶液 [STC，含1.2 mol·L-1 山梨醇、10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmo1·L-1 CaCl2]，PTC溶液 [含40% PEG4000、10mm Tris-HCl (pH 7.5)、50mm CaCl2] 抗生素氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)，潮霉素B(hygromycin B，HmB)。 原生质体制备 从培养皿上挑取少量菌丝于250 m三角瓶里摇床培养2d。三层擦镜纸过滤除去菌丝，获得孢子悬浮液，浓度约为1×107 cfu·mL-1 。1-2 mL孢子悬浮液到盛有