CharacterizationofCqinTeleosts重点分析.ppt

Page ? * Reporter：Liu Ge Characterization of C1q in Teleosts ——Insight into the Molecular and Functional Evolution of C1q Family and Classical Pathway 背景介绍——补体系统 补体系统包括30余种组分，其广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面，是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统。 具有调理吞噬、介导炎症、溶解细胞、清除免疫复合物和调节免疫应答等生物学功能。 补体的激活可分为三条途径：①经典途径；②MBL途径；③旁路途径； 背景介绍——经典途径 1、识别阶段： C1识别免疫复合物； 活化形成C1酯酶； 2、活化阶段： 活化的C1s依次； 酶解C4和C2，形成: C3转化酶(C4b2a)； C5转化酶(C4b2a3b)； 背景介绍——经典途径 3、膜攻击阶段： 形成攻膜复合物 细胞溶解 背景介绍——经典途径 背景介绍——C1q的结构 460KDa； 异源六聚体，“六朵郁金香花”； 18条多肽链（6A、6B、6C）； 背景介绍——C1q的结构 背景介绍——C1q的结构 Characterization of C1q in Teleosts 生物信息学分析 mRNA组织分布 多抗制备 鲫鱼血清经典途径的检测 一、生物信息学分析 1、斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC的全长cDNA分析： C1qA cDNA全长1148bp；ORF为744bp；编码247aa；5UTR为111bp；3UTR为293bp； C1qB cDNA全长913bp；ORF为729bp；编码242aa；5UTR为58bp；3UTR为126bp； C1qC cDNA全长932bp；ORF为735bp；编码244aa；5UTR为71bp；3UTR为126bp； 斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC的结构域分析： C1qA和C1qC都包含一个信号肽(SP)，一个胶原样区(CLR)和一个C1q domain(球状结构域)； C1qB含有两个胶原样区； 一、生物信息学分析 斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC的基因结构分析： 斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC的基因结构与其他物种的一致，都包含2一3个外显子和1一2个内含子。 一、生物信息学分析 斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC的序列比对分析： 斑马鱼C1qA与其他物种的C1qA的一致性为32-39%； 斑马鱼C1qB与其他物种的C1qB的一致性为25-35%； 斑马鱼C1qC与其他物种的C1qC的一致性为43-47%； 斑马鱼C1qA、B、C三者之间也存在约30%的一致性； 一、生物信息学分析 斑马鱼C1qA、C1qB和C1qC的系统进化分析： 一、生物信息学分析 二、斑马鱼C1q的mRNA组织分布 三、C1q头部结构域的多抗制备 四、鲫鱼血清经典途径的检测 Western Blot检测鲫鱼血清中的C1q： 上样：鲫鱼血清； 一抗：兔抗ghA 、ghB、 ghC； 二抗：羊抗兔抗体； SRBC 四、鲫鱼血清经典途径的检测 绵羊红细胞与溶血素（hemolysin）即抗绵羊红细胞结合，形成致敏绵羊红细胞（SRBCs）。 致敏绵羊红细胞与补体结合，使其激活，补体发生溶细胞作用，引起红细胞肿胀，发生溶血。 鲫鱼经典途径溶血活性检测： SRBC SRBC 补体-C1q SRBC SRBC 鲫鱼抗SRBC抗体 SRBCs SRBCs 鲫鱼经典途径溶血活性检测： 四、鲫鱼血清经典途径的检测 ghA、ghB、ghC结构域均参与C1q依赖的经典途径： 四、鲫鱼血清经典途径的检测 SRBC SRBC SRBC 补体-C1q SRBC SRBC 鲫鱼抗SRBC抗体 SRBCs SRBCs gh gh 溶血抑制率=溶血率(对照组)-溶血率(实验组)/溶血率(对照组) 四、鲫鱼血清经典途径的检测 ghA、ghB、ghC结构域均参与C1q依赖的经典途径： 致敏抗体：兔抗SRBC抗体—IgG 抗原：SRBC； 抗体：IgG（兔源）； 补体来源：豚鼠血清； 致敏抗体：鼠抗SRBC抗体—IgM 四、鲫鱼血清经典途径的检测 ghA、ghB、ghC结构域均参与C1q依赖的经典途径： 抗原：SRBC； 抗体：IgM（鼠源）； 补体来源：豚鼠血清； 四、鲫鱼血清经典途径的检测 ghA、ghB、ghC结构域均参与C1q依赖的经典途径： 致敏抗体：鲫鱼抗SRBC抗体—IgM 抗原：SRBC； 抗体：IgM（鲫鱼）； 补体来源：豚鼠血清； 结论： 斑马鱼中存在C1qA、C1qB、C1qC三个分子； 生物信息学分析