ELISA的原理与应用..重点分析.ppt

包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 3.1.4 　包被用抗体 IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。 3.1.5 　包被的条件 pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。 3.1.6 　封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭？ 3.4 　洗涤液 　　在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。 　ELISA的试剂准备B 3.2 　结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2抗体（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4结合物尚要有良好的稳定性。 3.2.1 　结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。 在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。 3.2.2　酶 纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。 3.2.3 　结合物的制备 （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%）和重复性好。 交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。 一步法 : 抗原或抗体+戊二醛+酶评价:重复性好但抗原、抗体、酶之间的比例不确定效率不高 二步法 : 酶+戊二醛?+抗原或抗体评价: 效率高，但产率更低如果是ALP常用一步法标记如果是HRP常用二步法标记 （2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而结合。 简便有效. 该法仅用于HRP标记 此法酶标记物产率较高，但是部分结合物可能聚合，抗体的活性有所降低 酶标记物需经纯化及鉴定 注意原则：结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。 3.2.4　结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。 3.2.5 　结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。 试剂准备 C 酶的底物 3.3 　酶的底物 3.3.1 　HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止