第四章酶的固定化和固定化酶反应动力学解析.ppt

第四章 酶的固定化与固定化酶反应动力学 内容 酶的固定化 辅酶的固定化 细胞的固定化 固定化酶促反应动力学 固定化酶的应用 第一节 酶的固定化 酶在使用中的不足 1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸、碱、有机溶剂 对其有影响）， 2.不能回收，无法自动化、连续化生产， 3.产物分离纯化增加困难。 固定化酶的源流 固定化酶的特点： 优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活，增加酶的成本 固定化酶的作用模型 制备原则 （1）保护酶蛋白的立体结构不变。 （2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用 （3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等 二、酶的固定化方法 1.载体结合法 将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。 根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。 物理吸附 作用力：氢键、范德华力 、疏水键等 吸附剂 无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等） 有机吸附剂（纤维素、胶原等）比较受重视。 特点 优点：酶活性中心不易被破坏，酶的高级结构变化少，操作简便。 缺点：酶与载体的结合力弱，酶易脱落。 吸附技术： a. 混合浴或振荡浴吸附法 b.反应器中直接吸附法 c. 电沉积法 物理吸附法固定化酶举例 离子结合 通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。 吸附剂 离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树脂等。 特点 比物理吸附的结合力要强，操作方便，条件温和，可再生后反复使用。 缺点吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。 1969年最早用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用DEAE-葡聚糖凝胶固定的。 共价结合 通过共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。 （2）所用载体 重氮法 将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。 b.溴化氰法 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 此方法固定化后相对酶活力比较高，且相当稳定，同时操作也简便。是最受欢迎的一种方法. c.叠氮法 在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。主要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反应，从而形成肽键。 d.烷化法 一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶,与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。 优缺点 发生作用的氨基酸残基 特点 反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低。尽可能地降低交联剂的浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活性的提高。 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。 克服的方法 酶先吸附在载体上，或者包埋在胶内，微囊内，再交联或者固定成酶膜，或者酶网颗粒 3 包埋法制备固定化酶 格子型固定化酶 （2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法） （3）制备的固定化酶 2 微型胶囊法 （2）特点 （3）微型胶囊法优缺点 固定化酶的制法及其特性比较 第二节　辅酶的固定化 辅基的固定化 对于必需辅基的酶，固定化酶时一般将辅基同时固定。 一般辅基分子和载体之间要接入0.5～1.0nm长的间隔基。 将辅基共价结合于载体上之前，要考虑在辅基分子的适当位置引入功能团，如引入羧基或氨基，使之易与载体偶联。 磷酸吡哆醛，FAD、FMN、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等可利用分子本身所具有的功能团。 将具有功能团的辅基先与间隔基结合，再与活化的载体偶联；或先使间隔基与活化载体结合，再与辅基偶联。 2、辅酶的固定化 辅酶与酶蛋白的结合是松弛的，在固定时要保证能与两种酶都能有最恰当的结合。 将辅酶固定于一高分子上，然后用微囊法将辅酶和两种酶一同包埋于微囊内。 高分子化一般的顺序是先在辅酶的一定部位引入适当的功能基团或间隔基，生成辅酶的衍生物，然后再与水溶性高分子共价结合。 第三节 细胞固定化 一、什么是固定化细胞？ 通过各种方法将细胞与水不溶性载体结合，制备固定化细胞的过程 细胞固定化包括： 1.微生物细胞固定化 2.植物细胞固定化 3.动物细胞固定化 4.原生质体固定化 固定化细胞特点 1.优点: (1)省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。 (2)细胞生长快、而且多、反应快。 (3)可以连续发酵，节约了成本，排除产物抑制和消耗。 (4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定。 2. 缺点： (1)保持菌体的完整，防止菌体自溶。 (2)防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时