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* * * * * * * * * * * * slide * DNA超螺旋的产生机制　 在真核细胞中，DNA的负超螺旋则主要是染色质的 结构造成的。因为DNA在组蛋白八聚体外面缠绕的方向有利于DNA向松缠方向转变。在核小体组装过程中，也肯定有DNA拓扑异构酶参加。在许多真核生物中部发现了拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶II。 slide * 常见的DNA分子形式 一般以相同核苷酸的线形双螺旋DNA分子的沉降常数作为1，其他各种分子取相对值。 沉降常数与电泳迁移率之间并不完全一致。 I形DNA：具有负超螺旋或正超螺旋的双链封闭环状分子。相对沉降常数1.4l。　　　 I0形DNA：没有超螺旋的双链封闭环状分子，也就是松弛形式(relaxed form )，相对沉降常数1.14。 II形DNA：在一条链上或两条链上有一个或几个切刻的双链环状分子，又称为切刻环(nicked cirle )，相对沉降常数1.14。 　 Ⅲ形DNA：线形双螺旋分子。相对沉降常数1.00。 坍缩DNA(collapsed DNA)：当I形成I0形DNA在碱变性或热变性时，其氢键断裂，而两条链无法分离，结果生成两条链紧密缠结的分子。坍缩DNA具有异常高的沉降常数，相对沉降常数约3.0。 单链环状DNA：相对沉降常数大约为1.14。 线性单链DNA：相对沉降常数为1.30。 环连DNA(catenated DNA catenane ):这是在DNA复制过程中的产物或由DNA旋转酶催化生成，由两个以上T形DNA分子环连而成。 以上八种DNA分子形式的转变表示于下图，其中前四种仍标以I、I0、II、Ⅲ后四种则分别以(5)、(6)、(7)、(8)表示。 　 slide * 第三节 DNA的变性与复性 变性（denaturation）或解链（melting） 将双链DNA缓慢地加温，使其氢键断裂，双链解开，产生单链DNA分子的过程。 复性（renaturation）或退火（annealing） 核酸分子在变性后，分开的互补链缓慢冷却，重新形成互补双连的过程。 1.下列因素可导致DNA变性： 高温、酸、碱、尿素、甲酰胺 常用的方法是热变性法和碱变性法。 2.DNA变性后物理性质发生的变化： （1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加； （2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为 增色效应（hyperchromic effect）。 3.增色效应(hyperchromicity) 由于DNA变性而引起的光吸收的增加称为增色效应。 双链DNA的A260=1.00（浓度为50μg/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）； 单链DNA的A260=1.37； 游离碱基或核苷酸的A260=1.60。 一、变性 4. DNA的熔解曲线 解链温度（melting temperature, Tm）或熔点： 是A260的升高达到极大值一半时（一般约为1.185）的温度。即是变性温度范围的中点。是鉴定DNA的参量。 DNA的熔解曲线：缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（一般0.1℃/min），记录各个温度下的A260数据，即可绘制DNA熔解曲线。从中可测出Tm 影响变性的因素： 外部条件：如温度和正离子的浓度。 浓度低于0.4mol/L，单价阳离子增高10倍，Tm增加16.6° 内部条件：GC含量及分子类型。 当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。 马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G +C)%， 或 GC%=（Tm-69.3）×2.44 二、复性 1.复性的条件： (1) 有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力； NaCl：0.15-0.5mol/L (2) 有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键。 一般比Tm低20-25℃ 2.复性的过程： DNA的复性对片段有两个要求： (1) 互补顺序的碰撞和排列； (2) 碱基的正确配对和氢键的形成。 具体过程分为： (1)成核作用：一般需10-20bp产生一个或几个双螺旋核心。 (2)拉拉链作用。 3.复性动力学 C 1 1 C0 2 1+KC0t1/2 C0 ：DNA初始浓度 C：复性时DNA浓度 t：复性时间 C0t：DNA浓度与时间