核酸操作的技术分析报告.pptVIP

4 核酸操作的基本技术 4.1 核酸的提取与纯化 4.2 核酸的检测与保存 4.3 核酸的凝胶电泳 4.4 核酸的分子杂交 4.1 核酸的提取与纯化 提取的目的：保持核酸的完整性。 需要注意的方面： 细胞内的核酸酶；化学因素；物理因素。 4.1.1 基本原理 化学试剂提取法：碱裂解法、煮沸法、有机溶剂抽提法、去污剂法等 离心分离法：超速离心、凝胶电泳 超速离心： （a）速度区带离心：蔗糖。 沉降速度与样品质量、密度、离心力大小、介质密度及样品与介质的摩擦力有关。 4.1.2 微生物DNA的提取 质粒DNA提取 细菌DNA提取 病毒DNA提取 质粒DNA提取 细菌DNA的提取 4.1.3 动物细胞DNA的提取 4.1.4 植物细胞的提取 4.1.5 核外DNA的提取 4.1.6 RNA的提取 总RNA提取： 常用方法：利用异硫氰酸胍裂解。 mRNA提取： 在总RNA提取的基础上进行亲和层析。 注意：RNase无处不在，需要做好实验预处理。 4.2 核酸的检测与保存 检测： 紫外光谱分析法和荧光分析法。 A260=1相当于 50μg/mL 双链DNA 保存： pH：TE； 温度：-20℃，-80℃。 4.3 核酸的凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲场凝胶电泳 4.4 核酸的分子杂交 原理：A-T(U),G-C互补配对。 可形成DNA:DNA，DNA:RNA双链分子。 主要步骤： （1）核酸转移； 电泳凝胶核酸印迹法、斑点印迹法、 狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。 （2）探针杂交。 探针的制备 探针：经放射性或飞放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。 探针种类： 同位素标记探针 生物素标记探针 地高辛标记探针 辣根过氧化酶标记探针 核酸杂交方法 Southern DNA杂交 Northern RNA杂交 斑点印迹杂交 菌落（噬菌斑）杂交 * * 核酸是基因工程研究的对象和材料，核酸操作技术的好坏对于基因工程的成败可产生决定性的影响。 4.1.1 基本原理 4.1.2 微生物DNA的提取 4.1.3 动物细胞DNA的提取 4.1.4 植物细胞的提取 4.1.5 核外DNA的提取 4.1.6 RNA的提取 组织细胞破碎 去除杂质（蛋白、糖类） 去除其他杂质核酸 脱盐、获得纯品 步骤： 1.CATB法：CATB（十六烷基三乙基溴化铵），能溶解细胞膜，与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液（0.7M NaCl）中可溶，降低盐浓度（0.3M）即可沉淀。 很好的去除糖类；初期能同时分离DNA和RNA。 2.SDS法：SDS（十二烷基硫酸钠）在55-65℃下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用高盐及降低温度的做法或用酚氯仿法使蛋白质变性，多糖沉淀，除去沉淀后用乙醇沉淀核酸。 操作简单、温和，可提取RNA和DNA，但糖类不易去除。 （b）密度梯度离心:CsCl。 沉降速度与密度有关。 分辨率：0.02g/mL 蛋白质：1.3g/mL DNA： 1.6-1.7g/mL RNA： 1.75-1.85g/mL 碱裂解法、 煮沸法、 去污剂裂解法。 细菌培养 菌体收集 裂解 离心去除沉淀 酚氯仿抽提 异丙醇沉淀 细菌细胞 洗涤获得纯品 悬浮细菌 碱裂解或煮沸或去污剂 酚氯仿抽提 12000rpm离心 上层水相 中间变性蛋白 下层有机相 乙醇沉淀 沉淀：63%乙醇（终浓度） 洗涤：70%乙醇 组 织 匀 浆 蛋白酶K消化 RNase消化 SDS裂解 高盐或酚氯仿抽提 乙醇沉淀 洗涤，获得纯品 组 织 匀 浆 CATB处理 高盐或酚氯仿抽提 乙醇沉淀 洗涤，获得纯品 去除RNA 组 织 匀 浆 差速离心分离细胞器 去除核DNA 蔗糖密度梯度离心 收集线粒体 裂解线粒体 DNA提取相关步骤 分类：低熔点琼脂糖和高熔点琼脂糖。 分辨率：差异高于200bp。 指示剂：溴酚蓝、二甲苯腈 染色：EB 缓冲液：TAE、TBE 分辨率高：可分离相同长度碱基组成不同的DNA片段； 需要样品量少：银染，可检测少量样品； 回收DNA纯度高； 分离超大DNA分子： 1-10Mb 用于基因组文库构建。 *