核酸分子杂交分析报告.pptVIP

目 录 DNA变性: 当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值条件下,维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离成两条单链,这一过程叫DNA变性。 核酸分子杂交的基本原理 引起核酸变性的因素 酸 碱 热 变性剂 （尿素） 有机溶剂 （乙醇） ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? DNA复性: 当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。 * 核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以DNA的变性、复性为理论基础 指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 液相杂交 * 一、Southern 印迹可用于分析基因拷贝数的变化 由E. M. Southern在1975年提出 可用于分析基因拷贝数的变化 基本操作过程包括 待测DNA样品的制备和基因探针的标记； 待测DNA样品的电泳分离； 电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物； 特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。 * Southern印迹分析基本流程 滤纸 NC膜 凝胶 滤纸 电泳 转移 杂交，显影 酶切DNA样品上样 DNA印迹 重物 缓冲液 利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。 * 二、Northern 印迹和RT-PCR可用于分析基因转录水平的变化 Northern blot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法； RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种方法； 二者均可用于分析基因转录水平的变化 。 Northern 印迹是应用DNA探针检测特异mRNA的，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小，其方法类似于Southern印迹杂交。 三、斑点印迹杂交(dot blotting) 狭缝印迹杂交（slot blotting） 将分离的RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 用于基因组中特定基因及其表达产物的定性和定量研究，不能测定分子量的大小。 * 四、原位分子杂交技术可用于基因及其表达产物的定位分析 原位杂交（in situ hybridization，ISH） 将标记探针与细胞或组织中的核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称为原位杂交（hybridization in situ)。 可用于基因及其表达产物的定位分析。 原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品， 可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某 类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质 序列。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测 * 箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH） 五、液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 1、RNA酶保护分析法原理 RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。 2、核酸酶S1保护分析法原理 核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法 六、固相杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固