核酸分子杂交技术扫盲版教学用分析报告.pptVIP

核酸分子杂交技术 扫盲版---教学用 * 不同来源的单链核酸分子 在一定 条件下 按照碱基 互补配对 的原则 形成双链杂交体的过程 2、碱基不完全互补配对也能杂交 1、可以是DNA, 也可以是RNA，但必须是单链 3、不同的分子形成的杂交体稳定性不同 利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术 目的：检测靶序列 碱基互补：DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 基本原理： 碱基互补、变性和复性 变性： 升高温度至94℃左右，使核酸双链解开为两条单链－－升高温度变性只是一种方式 复性： 缓慢降低温度（ 52℃左右），变性的两条单链重新形成互补双链。 hybridization DNA:DNA 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C DNA:RNA 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U RNA:RNA 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C 按参与反应分子 DNA和RNA的杂交 DNA和DNA的杂交 放射性标记 RNA和RNA的杂交 非放射性标记 按支持介质 原位杂交 液相杂交 按标记 固相杂交 菌落杂交 斑点杂交和狭缝杂交 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 基因芯片 固相杂交 菌落杂交 斑点杂交和狭缝杂交 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 阳性克隆鉴定 无需电泳和转膜 方便快捷 检测DNA 检测RNA 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性 3、靶序列： Northern印迹靶核酸为RNA； Southern 印迹靶核酸为DNA 探针:1. 能与靶序列杂交；2. 能被特异性检测。 寡核苷酸探针 RNA探针 DNA探针 优点：稳定；易得；易标记；杂交适宜的温度范围宽 优点：DNA探针的缺点；此外，杂交后可用RNA酶水解未杂交的RNA探针 缺点：杂交前需变性；杂交效率较低（竞争）；杂交体不如RNA稳定 缺点：标记复杂；不稳定（探针本身）；杂交适宜的温度范围窄 优点：短，穿透性好；可区分单碱基突变 缺点：携带的标记分子少，检测时敏感性较低；应用范围较窄 DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ （5’－3’核酸外切酶活性） DNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性 5’－3’ 聚合酶活性）＋3dNTP＋1dNTP# DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’ 聚合酶活性） 模板DNA 切开模板DNA形成一到几个碱基的缺口 掺入标记基团 缺口平移 DNA模板 引物和模板DNA结合 加入klenow片断、3种 dNTP和1种标记dNTP 引物延伸 ㈡杂交 ㈢信号检测 1、预杂交 2、杂交 3、洗脱 ㈠核酸分子与固 相介质的结合 1、探针的制备 2、核酸变性、转移、固定 扩增、标记 纯化 检测 为获得更好的杂交效果 控制条件，特异结合 洗去多余探针 检测标记物 *