第六酶与细胞固定精要.ppt

第六章 酶与细胞固定化 直接应用酶的不足之处: (1)酶的稳定性差;在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活 (2)酶的一次性使用；酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产 (3)产物分离困难；酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难 发展历史 1953年,德国,Grubhofer、Schleith,聚氨基苯乙烯树脂为载体，重氮法; 1969年，日本，千烟一郎，固定化氨基酰化酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出; 1971年，第一次国际酶工程会议确定固定化酶统一英文名称为Immobilized Enzyme。 1973年，日本首次在工业上成功应用固定化大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 1976法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精； 1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀粉酶， 1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功； 1982年日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸。 种类 优点 (1)提高酶稳定性； (2)可反复或连续使用,成本降低; (3)易于和反应产物分开,简化提纯工艺; （4）酶反应过程可严格控制； （5）较游离酶更适合多酶反应； （6）增加产物收率，提高产物质量； 第一节 酶固定化 固定化酶制备原则 （1）维持酶的催化活性及专一性； （2）有利于生产自动化、连续化；载体要有一定的机械强度，以免搅拌而破碎。 （3）应有最小的空间位阻；尽可能不妨碍酶与底物接近 （4）酶与载体必须结合牢固；以便回收重复使用 （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应液发生化学反应； （6）成本要低。 1、吸附法(link) 2、包埋法(link) 3、结合法(link) 4、交联法(link) 5、热处理法(link) 1、吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法; 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落. (3)既能吸附酶也能吸附其它物质，因此吸附的选择性差。 2、包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法 多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等 (2)半透膜包埋法 半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小 适用性：底物和产物都是小分子物质的酶 微胶囊直径一般只有几微米至几百微米? 3、结合法 选择适宜的载体,通过共价键或离子键(非共价健)与酶结合在一起的固定化方法 重氮法 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团 迭氮法 含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成迭氮化合物 溴化氰法 含有羟基的载体，如纤维素等，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物 烷基化法 含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体 4、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构 特点此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体 双功能试剂戊二醛、己二胺、双偶氮苯等 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间交联的固定化酶 5、热处理 在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体体内 适用性：热稳定性较好的酶的固定化 严格控制加热及其时间 酶固定化方法示意图 固定化酶方法的优缺点比较 评估指标 判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性,常见的评估指标有以下几条:　(1)相对酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力. ＝固定化酶活力/（总酶活力－未结合的酶活力） 它与载体的结构、颗粒大小、底物分子量大小及酶的结合效率有关．相对酶活力低于75%的固定化酶,一般没有实际应用价值． 　 （2）酶结合效率（偶联率） ＝（总酶活力－未结合的酶活力)/总酶活力 ＝（总酶蛋白－未结合的酶蛋白）/总酶蛋白 偶联率＝1时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；偶联率＜1时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率＞1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。 (3)酶活力回收率： 固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力的百分比称为酶的活力回收率。＝固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力 测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果．一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果． (4)固定化酶的半衰期 即固定化酶的活力下降到为初始活力一半所经历的时间。它是衡量固定化