微物四.doc

微物四第五組 林千椀 流氏細胞儀，細胞PI染色觀察環境污染物對動物細胞之毒性影響 實驗日期：120805 實驗預習：事先預習流氏細胞儀的機器原理及操作步驟，以及不同環境毒物對細胞的毒性。 實驗目的：利用流氏細胞儀偵測不同環境毒物對細胞的傷害 實驗原理： 利用流氏細胞儀可以快速偵測細胞的數量，大約每一秒可以偵測到100~3300個細胞，同時可以總共偵測到3000~100000個細胞。 流氏細胞儀的散射光（light scatter）有分為兩種，分別為正前方（forward angle light scatter，簡稱FS）及側邊光（side scatter，簡稱SS）。FS隨著細胞數增加而增加；SS隨著細胞顆粒及密度增加而增加。 流氏細胞儀的螢光共分五種：綠光，525nm；黃光，575nm；橘紅光，615nm；紅光，675nm；遠紅光，755nm。 在進行流氏細胞儀偵測時，為了排除雜訊，我們將FS設為100。FS＜100，則當做雜訊；FS＞100時，則設定為所需要的細胞。 實驗步驟： ＜立即毒性＞ 細胞以PBS清洗，刮下製成細胞懸浮液。 於流式細胞儀專用小管中加入990?L PBS及10??L藥物，均勻混和。 細胞加入細胞儀專用小管中，避光培養30分鐘。 加入PI 5?L（PI之最終濃度為5?g/mL），避光培養10分鐘。 以流式細胞儀分析。 ＜長期毒性＞ 培養基中加入藥物，以替換原本的細胞培養基，培養1天。 細胞以PBS清洗，刮下製成細胞懸浮液。 於流式細胞儀專用小管中加入900?L PBS及100??L細胞懸浮液。 加入PI 5?L（PI之最終濃度為5?g/mL），避光培養10分鐘。 以流式細胞儀分析。 實驗結果： BBP 10μl對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果BBP 10μl對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果BBP10μl對HeLa cells作用一天後，經由流式細胞儀偵測的結果 結果討論： 由圖一及圖二的結果中可以得知，以DMSO 1％處理細胞30分鐘之後，細胞的存活率為76.1％及67.0％，可以看出DMSO對細胞具有毒性。然而以BBP10μl對細胞處理30分鐘後，結果如圖三及圖五。由圗中可以看出細胞存活率提升為68.0％及69.4％，加入BBP10μl之後，細胞的存活率反而上升。而再以BBP5μl對細胞處理30分鐘後，可得結果如圖四及圖六。由圗中可以得之細胞存活率為63.8％及64.5，跟以DMSO 1％處理細胞30分鐘之後比較，細胞存活率下降。再以BBP10μl對細胞處理一天，可以得結果如圖七及圖八，由結果中可以得之細胞存活率為85.9％及85.0％，可以得知細胞的存活率又再度上昇，故推測BBP在10μl時可以造成細胞增生。實驗心得： 圖一、DMSO 1%對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果 圖二、DMSO 1%對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果 圖三、BBP 10μl對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果 圖四、BBP 5μl對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果 圖五、BBP 10μl對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果 圖六、BBP 5μl對HeLa cells作用30分鐘後，經由流式細胞儀偵測的結果 圖七、BBP10μl對HeLa cells作用一天後，經由流式細胞儀偵測的結果 圖八、BBP10μl對HeLa cells作用一天後，經由流式細胞儀偵測的結果