第二动物细胞培养精要.ppt

动物细胞培养的发展历史 1859年,法国解剖学家Valpian最早尝试了蛙胚尾部组织的体外培养. 动物细胞培养中的常用术语 细胞培养；组织培养；器官培养 原代培养；传代培养；代 细胞系；细胞株 有限细胞系；无限细胞系 体外转化；体外恶性转化 细胞分裂指数；克隆形成率 第一节 细胞培养需要具备的基本条件 体外培养细胞的基本特征 （一）体外培养细胞的分型 １.贴附型： （二）体外培养细胞的超微结构 细胞外被：糖蛋白膜，利于细胞贴壁。 1. 培养细胞的增殖态和功能态 2.培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells） 注: 细胞永生性和恶性性非同一性状。 　　细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程如细胞种类、支持物、促贴附物质等。 二、影响细胞培养的理化因素 无菌、无毒：体外培养细胞的首要条件。 风淋室 传递窗 大容量高压灭菌器 全自动三重纯水蒸馏器 超纯水装置 滤 器 四、器具的清洁与无菌操作 (一)常用器具的清洗 1.玻璃器皿 清水浸泡 软毛刷沾洗涤剂刷洗 自来水冲洗 晾干 酸液浸泡过夜 自来水冲洗10次以上 三蒸水漂洗三次 烘干备用 酸液的配制 2. 塑料及橡胶制品 清水浸泡 2%NaOH浸泡过夜 自来水冲洗 5%稀盐酸浸泡30分钟 自来水冲洗10次以上 三蒸水漂洗3次 晾干备用 3.金属制品的清洗 毛刷沾洗净剂刷洗或75%酒精擦洗 自来水反复冲洗 三蒸水漂洗3次 烘干备用 (二)器具的灭菌与消毒 无菌室与工作台消毒 第二节 培养基及各种细胞培养用液 培养液 1.平衡盐溶液（BSS） 同时具备缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应等特点。 　 血清、水解乳蛋白、胚胎浸出液、 组织液、淋巴液和血浆等 血清中所含大体成分 多种蛋白质（白蛋白，球蛋白，铁蛋白 及转移蛋白等） 多种金属离子 激素 促贴附物质 各种生长因子 不明成分 天然培养基与人工合成培养基的比较 5.消化液 胰蛋白酶液:牛胰脏中提取的黄白色粉末，作用强烈，对细胞伤害大。 EDTA液:通过鏊合钙离子等，改变细胞间的连接，使组织或细胞分散成单个细胞 胶原酶液：细菌中提取，作用温和。 　表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别 　项 目 　　 胰蛋白酶 　　胶原酶 消化特性组织 　适用于消化软组织 适用于消化纤维多的 　用 量 　　 0.01%～0.5% 0.1 ～ 0.3mg/ml 消化时间 　　　0.5～2小时（小块） 1～12小 　　pH 　 8～9 6.5～7.0 作用强度 　　　 强烈 缓和 细胞影响 　　　 时间过长有影响 无大影响 血清钙镁离子 　　　 有影响 无影响 6.pH调整液 NaCO3溶液：常用浓度有7.4%， 5.6%和3.7%三种 Hepes液：羟乙基哌嗪乙璜酸，氢离子缓冲剂 第三节 原代及传代细胞培养 一、 原代培养 鼠胚组织取材 鸡鸭鸟类胚胎组织取材 组织块培养法 分散细胞培养法 机械分散法 细胞计数 方法: 计数板的准备 染色 加悬液 镜检 动物细胞原代培养过程图 思考：传代前为何要换液？怎样判断污染？ 根据细胞生长的特点，传代方法有3种： 悬浮生长细胞传代 离心法传代： 直接传代法： 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 四、体外培养细胞的纯化 第四节 培养细胞的常规检测 微生物污染的检测与排除 一、微生物的检测与排除 2.细菌污染的检测 ①肉眼观察培养液是否混浊,颜色是否变黄 ②显微镜下观察是否有菌体 ③取培养液进行细菌培养是否出现菌落　 3.支原体污染的检测 细胞病变效应检测 4.病毒污染的检测 细胞病变效应检测 （三）微生物污染的排除 抗生素 加温法 巨噬细胞吞噬法 动物体内接种法 二、细胞形态观察 光学显微镜：细胞形