第三动植物细胞培养产酶精要.ppt

产酶实例 —— 大蒜细胞培养产 SOD 大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮 先用70% 乙醇消毒 20 s，再用0.1%升汞消毒 10 min，然后无菌水漂洗3次 在无菌条件下，切成0.5 cm3 的小块，植入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的半固体 MS 培养基中 25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下培养18天，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次 三、植物细胞培养产酶实例 产酶实例 —— 大蒜细胞培养产 SOD 大蒜细胞悬浮培养 将上述在半固体 MS 培养基上培养18天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养10～12天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞 无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养18天 SOD 分离纯化 收集细胞，破碎，用pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取 三、植物细胞培养产酶实例 第三节 动物细胞培养产酶 一、动物细胞及其培养特点 二、动物细胞培养的工艺流程 三、动物细胞培养产酶实例 1907年，Harrison 开创了动物组织培养的先河 从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经纤维 1950s，Earle 用动物细胞培养制取病毒疫苗 1967年，动物细胞贴壁培养微载体开发 1975年，杂交瘤技术 动物细胞可产生较高价值的物质 激素、疫苗、单克隆抗体、酶 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养产酶 动物细胞结构 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞特性 没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物） 体积比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞 在肌体内相互粘连，以群体形式存在 在培养时具有群体效应、贴壁依赖性、接触抑制性、功能全能性 营养要求复杂（血清培养基） 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养的特点 主要用于生产蛋白质 生长缓慢 容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素 对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构） 大部分具有贴壁依赖性 —— 贴壁培养 培养基成分复杂，价格高昂 细胞生命有限，一般最多继代培养50代即退化死亡 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养方式 —— 悬浮培养 适用于非贴壁依赖型细胞 杂交瘤细胞、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞 类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别 对通气、搅拌耐受性差 对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例 CO2 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养方式 —— 悬浮培养 优点（相对于贴壁培养） 细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好 传代培养容易，无需消化分散细胞 培养基中营养成分利用率高 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养方式 —— 贴壁培养 适用于贴壁依赖型细胞 上皮细胞、成纤维细胞 细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂 滚瓶培养系统 结构简单，但比表面积小 微载体培养系统 由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球 兼具单层培养和悬浮培养的优势 细胞生长环境均一 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养方式 —— 固定化培养 贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用 吸附法 载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 贴壁型细胞的微载体培养即属此类 包埋法 将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中 细胞不易脱落 固定化培养优点 细胞损伤程度低，可重复使用 产物分离容易 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养产酶 动物细胞培养过程 种质细胞 体细胞（动物体内组织取出） 杂交瘤细胞 基本工艺过程 一、动物细胞及其培养特点 动物细胞培养基 氨基酸：各种必需氨基酸，Gln 等，作为碳源和能源利用 维生素：B族和维C，可由血清提供 无机盐：调节渗透压 微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供 葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸） 激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松等，可由血清提供 生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，一般来源于血清 一、动物细胞及其培养特点 培养基配制 配制母液，使用前过滤除菌、稀释；Gln 单独配制，冷冻保存 一、动物细胞及其培养特点 二、动物细胞培养的工艺流程 温度 哺乳动物细胞培养一般控制在 36.5±0.25 oC 温度也影响 CO2 溶解度，从而影响培养液 pH 值 渗透压 保持细胞内外等渗状态，一般700～850 kPa 溶解氧 供氧不足：细胞生长受抑制 过量供氧：容易产生较