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结果五： In vitro 随着氧化损伤增加，端粒缩短加剧 结果五： In vitro Discussion 1、p16---复制性衰老 p21---氧化损伤 因此纤维帽中VSMC的衰老是共同作用的结果 2、早期血管损伤也有损伤处端粒的显著缩短 3、首次用QTELI-FISH的方法对斑块中的端粒损伤进 行了精确的细胞定位，并联系了斑块的进展 4、不仅是复制，VSMC的衰老和凋亡也造成端粒缩短 5、氧化损伤可加速VSMC复制性端粒缩短 不足：未排除其他原因 VSMCs and Aging and telomere 陈宇 2013-10 atherosclerosis plaque VSMC senescence apoptosis aging 动脉粥样硬化—老年性疾病 细胞衰老—端粒缩短 细胞水平的明确联系 Introduction 斑块内部的细胞构成 巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞、脂质 衰老细胞表征 β-gal染色蓝染 端粒长度缩短 端粒缩短机制 复制 DNA氧化损伤?? 斑块与ROS关系已明确 推论：ROS—DNA损伤 端粒缩短—细胞衰老 斑块相关 解决问题：具体是那种细胞的衰老，与斑块是否相关 ？ ？ 材料：同一患者斑块中细胞与正常组织细胞衰老指标的检测， 检测指标：β-gal P16/P21 等 端粒长度 斑块组织短于正常组织 与AS严重程度相关 目的：AS斑块与VSMCs衰老的直接证据----机理探讨---抑制AS 机理探讨：端粒长度 端粒酶活性 DNA氧化损伤 + -- 新意与学习重点 1、 与 的双重验证 2、同一病人不同组织体内体外的检测、对照 3、端粒缩短具体到组织，细胞 4、端粒受损不仅是复制的结果， 还是氧化损伤的结果 严谨、全面、细腻的实验风格 需要对该领域理论知识、实验知识的全面了解 In vivo In vitro 实验材料—In Vitro 冠状动脉平滑肌细胞（n=10） 心脏移植术患者 斑块及周围组织平滑肌细胞（n=50） 颈动脉内膜剥脱术患者 严格的细胞确认： VSMCs were isolated,cultured, and characterized using immunofluorescence labeling for α–smooth muscle actin ( α-SMA), sm muscle myosin, calponin, desmin, and vimentin. 污染细胞的排除：Contamination with other cell types was excluded using markers for ECs, macrophages, and T lymphocytes. 实验方法 端粒长度检测（southern） β-gal检测，端粒的原位荧光杂交 细胞周期蛋白的检测（western） hTERT， Cyclin D1，CDK4转染(adenovirus) RTQ-TRAP检测端粒酶活性 ROS检测（流式，荧光镜检） 组化实验结果（斑块组织） 斑块纤维帽中的平滑肌细胞发生了早衰(18%蓝染，正常组织未见) 斑块 n=6 正常组织 n=6 结果一： In vivo 组化实验结果（斑块组织） 排除了纤维帽中淋巴细胞和巨噬细胞的衰老—主要是VSMCs的衰老 In vivo 结果一： 组化实验结果（斑块组织） 衰老相关的周期蛋白p16/p21参与了VSMCs的衰老 ( 70% 90%) P16/P21表达在正常组织未见；而p27在两种组织都可见，与斑块无相关性 In vivo 结果一： 取自斑块和正常组织VSMCs表现出β-gal染色、细胞形态、倍增时间差异 In vitro 结果一： 可能标错了 In vitro 结果二： In vitro 体外转染的方法确定pRB参与斑块细胞的衰老 转染后细胞进入细胞周期，DNA合成增加，逆转了周期抑制。 In vitro 取自正常组织的细胞(n=3)不同培养代数端粒长度的比较。 显示端粒长度随培养代数增加而缩短，约100bp/代 证明端粒随VSMCs衰老而缩短。 结果三： In vivo N=20 冠脉组织来自心脏移植病人，包括扩心病和心肌缺血病人(40